Технология производства вакцин против сальмонеллеза телят и поросят

Технология изготовления сальмонеллезных вакцин

Технологическая схема изготовления инактивированных (I) и живых (II) вакцин

Технологическая схема изготовления инактивированных (I) и живых (II) вакцин

Технологическая схема изготовления инактивированных (I) и живых (II) вакцин

Производственные штаммы - контроль свойств, поддержание и хранение

Для поддержания и хранения производственных штаммов сальмонелл производят их сублимацию.

С этой целью с МПА культуру смывают защитной средой, в качестве которой используют стерильное обезжиренное молоко, среду для грамотрицательных бактерий и т.д., замораживают и сублимируют.

Сухую расплодку используют в производстве в течение 2-3 лет. Перед использованием расплодок производят их проверку на соответствие паспортным данным. В работу берут штаммы, которые соответствуют свойствам, отмеченным в паспорте. Культуры сальмонелл, не отвечающие хотя бы по одному показателю, бракуют и утилизируют путем стерилизации.

С целью получения расплодки штамма ампулу с сухой культурой вскрывают, вносят в нее 0,5-1,0 см3 МПБ, ресуспендированную баксуспензию пересевают на флакон с МПБ. Далее культуру трижды через 5-8 часов пересевают на флаконы с МПБ, после чего баксуспензию рассевают на 3-4 чашки Петри с МПА по методу Дригальского с целью получения изолированных колоний.

Выросшие колонии через 16-20 часов при температуре 37-39°С просматривают под микроскопом, отбирают не менее 6-8 колоний S-формы, переносят их бактериологической петлей на полужидкий агар или МПА, выращивают 16-20 часов при температуре 37-38°С. На полужидком агаре культуры хранят в холодильнике при температуре 2-8°С в запаянных пипетках или пробирках с парафинированными пробками в течение 3 месяцев.

В процессе изготовления вакцины у производственных штаммов изучают морфологические, культуральные, ферментативные, вирулентные и антигенные свойства.

Культуры должны отвечать следующим требованиям:

Морфологические свойства.

Сальмонеллы представляют собой грамотрицательные палочки, спор и капсул не образуют, обладают различной степенью подвижности. Подвижность сальмонелл определяют посевом культур на полужидкий агар или исследуют культуру методом “висячей капли”.

Культуральные свойства.

Сальмонеллы образуют на поверхности МПБ равномерное помутнение среды, незначительный легко разбивающийся осадок, на МПА через 16-24 часа инкубации - круглые, выпуклые с гладкой поверхностью и ровными краями колонии S-формы.

Для контроля диссоциации культуры сальмонелл выращивают в течение 16-24 часов на МПА, смывают физиологическим раствором, доводят концентрацию до 1-2 млрд м.к./см3 по оптическому стандарту мутности и прогревают в водяной бане при температуре 100°С в течение часа. Учет реакции производят через 1 и 24 часа после термообработки.

Культуры S-формы после кипячения не термоагглютинируют и осаждаются в виде “пуговицы” на дно пробирки, при встряхивании легко ресуспендируются в виде равномерной взвеси.

Культуры SR- и R- формы после кипячения термоагглютинируются и осаждаются в виде “зонтика” на дно пробирки, при встряхивании “зонтик” разбивается на хлопья и комочки. Такие культуры нельзя использовать для производства вакцины и их бракуют.

Производственный штамм Salmonella dublin № 373 принадлежит к серогруппе Д1 и содержит антигены: соматические О19, О12, Vi и жгутиковые “g” и “р”. Штамм ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, ксилозу, сорбит, арабинозу, дульцит. Данный штамм патогенен для белых мышей, морских свинок и телят. ЛД50 для белых мышей массой 14-16 г при подкожном введении составляет 100 микробных клеток.

Производственный штамм Salmonella choleraesuis 370 принадлежит к серогруппе С1 и содержит антигены: соматический О6 и О7 и жгутиковый I фазы “С” и II фазы 1 и 5. Указанный штамм ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, манит, ксилозу и сорбит. Штамм патогенен для белых мышей, морских свинок, голубей и поросят. ЛД50 для белых мышей массой 14-16 г при подкожном введении составляет 100 микробных клеток.

Производственный штамм Salmonella typhimurium 371 принадлежит к группе “В” и содержит антигены: соматические О1, О4, О5, и О12 и жгутиковые I фазы “i” и II фазы 1 и 2. Данный штамм ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, ксилозу, сорбит, арабинозу и дульцит. Он патогенен для белых мышей, морских свинок, голубей, ягнят и телят. ЛД50 для белых мышей массой 14-16 г при подкожном введении составляет 100 микробных клеток.

Производственные штаммы S. typhimurium 371, S. dublin 373 и S. choleraesuis 370 используют при изготовлении инактивированных вакцин.

Производственный штамм Salmonella choleraesuis TS-177 принадлежит к серогруппе С1, непатогенен. При подкожном введении 10 млн.м.к./см3 вызывает гибель не более 2 из 10 белых мышей массой 16-18 г. По морфологии штамм представляет собой грамотрицательную палочку. На МПБ штамм через 8-10 часов роста вызывает равномерное помутнение среды, на МПА образует колонии S-формы, на МППЖА - диффузный рост. Штамм при посеве на среде, содержащей углеводы и многоатомные спирты, ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, маннит, сорбит, дульцит, арабинозу, ксилозу, не ферментирует лактозу, сахарозу, не свертывает молоко, не разжижает желатин, не образует индол, образует сероводород. Штамм агглютинируется сальмонеллезными монорецепторными сыворотками О-6, 7; Н-с; 1; 5.

Производственный штамм Salmonella dublin № 6 принадлежит к серогруппе Д1, апатогенен. ЛД50 для белых мышей массой 14-16 г составляет 107 микробных клеток, а для морских свинок массой 400 г - 1010 микробных клеток. Штамм получен из популяции стрептомицинзависимого мутанта и по морфологии представляет собой грамотрицательную палочку. На МПА штамм через 24 часа роста образует колонии S-формы, на МПБ - через 10-12 часов вызывает равномерное помутнение среды, а на МППЖА через 24 часа - диффузный рост. Штамм при посеве на среды, содержащие углеводы и многоатомные спирты, ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, мальтозу, маннит, ксилозу, дульцит, арабинозу, сорбит, образует сероводород, не образует индол. Штамм агглютинируется сальмонеллезными монорецепторными сыворотками О-1, 9, 12 и Н-g, м.

Производственный штамм Salmonella typhimurium № 3 принадлежит к серогруппе В, непатогенен. ЛД50 для белых мышей массой 14-16 г составляет 107, а для морских свинок массой 300-500 г - 510 микробных клеток. Штамм получен из стрептомицинзависимого мутанта и по морфологии представляет собой грамотрицательную палочку. На МПА штамм через 24 часа роста образует колонии S-формы, на МПБ - через 10-12 часов вызывает равномерное помутнение среды, а на МППЖА через 24 часа - диффузный рост. Штамм при посеве на среды, содержащие углеводы и многоатомные спирты, ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, маннит, ксилозу, дульцит, арабинозу, не свертывает молоко, не разжижает желатин, образует сероводород, не образует индол. Штамм агглютинируется сальмонеллезными монорецепторными сыворотками О-1, 4, 5, 12 и Н-1, 2.

Производственные штаммы S. typhimurium № 3, S. dublin № 6, S. cholerarsuis TS-177 используются для изготовления сухих живых вакцин.

Приготовление питательных сред

Приготовление бульона Хоттингера.

Фарш мышечной ткани крупного рогатого скота ресуспендируют в очищенной воде в соотношении 1:1,5. На 1 дм3 смеси добавляют 200-300 г поджелудочной говяжьей железы, 10-20 г хлороформа (консервант). рН приготовленной смеси доводят раствором двууглекислой соды или раствором натрия гидроокиси. Ферментолиз ведут при рН 8,0 и температуре 38-42°С в течение 4-5 суток.

Первые 6-8 часов перемешивают через каждый час, а затем 3-4 раза в сутки.

В процессе ферментолиза ежедневно определяют рН среды и корректируют ее 10%-ным раствором натрия гидроокиси или двууглекислой соды.

Биохимические показатели ферментолизата (перевара):

общий азот - 800-1200 мг%;

аминный азот - 600-900 мг%;

триптофан - 100-200 мг%.

Биохимические показатели контролируют согласно ГОСТ 20730-75 “Мясопептонный бульон для ветеринарных целей”.

К полученному ферментолизату добавляют 5-10 см3/дм3 хлороформа. Смесь инкубируют при температуре 90-100°С в течение 30-40 минут, охлаждают до температуры 15-25°С, отстаивают в течение 24-48 часов.

Прозрачный надосадок декантируют и разводят очищенной водой до содержания аминного азота 200-250 мг%, триптофана - 60-80 мг%.

В приготовленный мясной гидролизат добавляют до 0,5% пептона, 0,5% натрия хлорида, 0,3% химически чистого двухосновного фосфорнокислого натрия.

К бульону Хоттингера добавляют 10% воды на выкипание. Среду кипятят в течение 30 минут, рН среды устанавливают 10%-ным раствором натрия гидроокиси или двууглекислой соды до рН 7,6-7,8.

Среду кипятят в течение 1 часа, отстаивают в варочном котле в течение 1-2 часов, фильтруют до полной прозрачности через плотный слой ваты и марли.

Вместо бульона Хоттингера допускается использование двухкомпонентной питательной среды из гидролизатов белков крови. Для ее изготовления используют кровь убойных животных, форменные элементы - отходы сывороточного производства. Кровь предварительно путем сепарации (центрифугирования) разделяют на плазму и эритроцитарную массу, которые раздельно ферментируют, очищают и для приготовления среды смешивают в определенном соотношении. Сущность метода приготовления двухкомпонентной питательной среды не раскрывается, та как он является “ноу-хау” и оформлен патентом.

Для повышения выхода биомассы бактериальных клеток к питательной среде добавляют 3-5% препарата ЩПГСК, 18,7-22,5 мг/ дм3 левамизола, 4-5 мг/ дм3 никотиновой кислоты и пиридоксина гидрохлорида, 25 мг/ дм3 тиамина хлорида, 8-10 мг/ дм3 пантетената кальция, 50 мг/ дм3 сульфата магния, 50 мг/ дм3 тиосульфата натрия и др.

Выращивание посевного материала 1 генерации

Бульон Хоттингера, среду на основе гидролизата белков мясокостной муки (ГБММ) или двухкомпонентную питательную среду на основе гидролизатов белков крови (ГБК) разливают в стеклянные флаконы емкостью 100-200 см3 до 50% их объема, укупоривают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при температуре 116-118°С в течение 45 минут.

Каждую монокультуру сальмонелл в объеме 0,5 см3 с полужидкого агара или сухой ампулы, после ресуспендирования в одной из питательных сред, засевают в отдельный флакон с питательной основой.

Культуры выращивают при температуре 36-38°С в течение 8-10 часов. Полученные культуры проверяют на чистоту путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму, антигенную структуру - с монорецепторными сальмонеллезными сыворотками.

Выращивание посевного материала 2 генерации

Проверенные монокультуры сальмонелл засевают из флаконов в количестве 20-25 см3 в стеклянные бутыли емкостью 10-16 дм3, содержащие 5-6 дм3 питательной среды (бульон Хоттингера, ГБММ или ГБК). Культуры выращивают в течение 16-18 часов при температуре 37-38°С. Полученные культуры проверяют на чистоту роста микроскопией мазков, окрашенных по Граму, и антигенную структуру - с монорецепторными сальмонеллезными сыворотками.

Допускается выращивание посевного материала в ферментере объемом 5-100 дм3 в течение 6-8 часов при температуре 36-38°С. Ферментер загружают стерильной питательной средой (бульон Хоттингера, ГБММ или ГБК) на 1/3 его объема. Для повышения выхода биомассы и иммуногенности вакцины в питательную среду вводят витамины, микроэлементы и стимулирующие добавки.

Получение производственных монокультур сальмонелл в ферментере

Выращенные монокультуры 2 генерации и проверенные на чистоту, засевают в отдельные стерильные ферментеры в количестве 8-10% культуры из баллонов или 5% монокультуры из ферментера.

Культивирование сальмонелл осуществляют в ферментере объемом 0,63 м3 заполненном на 1/3 стерильной питательной средой (бульон Хоттингера, ГБК или ГБММ) в течение 8-12 часов при температуре 37-40°С и постоянном перемешивании (120 об/мин) и подачи стерильного воздуха.

В процессе культивирования сальмонелл осуществляют дробную подачу стерильного раствора глюкозы.

В процессе роста рН культуры поддерживают в пределах 7,2-7,6.

Для повышения выхода биомассы сальмонелл и иммуногенности вакцины добавляют в питательные среды витамины, микроэлементы и стимулирующие добавки.

По окончании культивирования определяют концентрацию культур, чистоту роста микроскопией мазков, окрашенных по Граму.

Изготовление инактивированной вакцины против паратифа поросят и телят

Для изготовления биопрепарата используют исходные культуры S. dublin № 373, S. typhimurium № 371, S. choleraesuis № 370, которые разводят физиологическим раствором до концентрации 4 млрд.м.к./см3 в отдельных стерильных сборниках для инактивации. К баксуспензиям добавляют формалин(содержание формальдегида не менее 36%) до конечного содержания 0,3-0,4%. Используют для инактивации также перекись водорода, димерэтиленимин.

Инактивацию культур проводят в течение 15-18 суток при температуре 37-42°С или 7 суток при температуре 37-38°С и 30 минут при температуре 560 С.

В процессе инактивации суспензию перемешивают в течение 5 минут 2 раза в сутки. После окончания процесса инактивации берут пробу для проверки на чистоту роста путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму, и посева на питательные среды: по 3 флакона с МПБ и МПА и 3 пробирки с МПА и МПБ и средой Сабуро.

В течение 10 суток все посевы на питательных средах должны оставаться стерильными.

Составление серии вакцины против паратифа поросят

Чистые проинактивированные монокультуры сальмонелл S. dublin, S. choleraesuis и S. typhimurium с концентрацией 4 млрд.м.к./см3 смешивают в соотношении 1: 1. К смеси монокультур добавляют до 0,1% алюмокалиевых квасцов, а через 6-24 часа до 0,1% хлористого кальция. Квасцы и хлористый кальций добавляют в виде 10%-ных растворов, простерилизованных в течение 1 часа при температуре 118-1200 С. Одновременно вакцину подщелачивают 10%-ным раствором натрия гидроокиси до рН 7,6. Приготовленную вакцину через 2 суток после ее составления высевают на питательные среды: по 3 флакона с МПБ, МППБ и 3 пробирки с МПА и средой Сабуро. На третьи сутки из посевов на МПБ делают пересев на 3 пробирки с МПА, МППБ и МПБ.

Расфасовка вакцин

После установления стерильности (отсутствия роста на питательных средах) вакцину расфасовывают по 50, 100 и 20 см3 соответственно в чистые стерильные стеклянные флаконы емкостью 50, 100 и 200 см3.

Контроль вакцины против паратифа телят и поросят

Контроль биопрепарата проводят путем определения следующих показателей: - внешнего вида;

- стерильности;

- безвредности;

- активности;

- концентрации водородных ионов (рН).

Определение внешнего вида.

Для определения внешнего вида все флаконы с вакциной встряхивают, просматривают в проходящем свете. Одновременно проверяют правильность маркировки.

Флаконы с вакциной должны быть без трещин, плотно укупорены, содержать жидкость соломенно-желтого цвета с серо-белым осадком, без посторонних механических включений.

Определение стерильности.

Для контроля стерильности вакцину высевают на питательные среды: МПА,МПБ, среду Сабуро и Китта-Тароцци. В посевах на питательных средах рост посторонней микрофлоры должен отсутствовать.

Определение безвредности.

Для проверки на безвредность вакцину вводят внутрибрюшинно 4 белым мышам массой 16-18 г в дозе 0,3 см3 и внутримышечно 2 кроликам в дозе 3,0 см3 (по 1,5 см3 в каждое бедро с внутренней стороны).

Все животные должны оставаться живыми и здоровыми в течение 10 суток после иммунизации.

Определение активности.

Смесь вакцины вводят внутримышечно 10 голубям в дозе 1 см3. Через 16-20 суток после введения вакцины всех вакцинированных голубей и 5 контрольных (не вакцинированных) заражают внутримышечно 2 ЛД50 дозой культуры S. choleraesuis № 370 при контроле вакцины против паратифа поросят и 2 ЛД50 дозы культуры S. dublin при определении иммуногенности вакцины против паратифа телят.

Невакцинированные голуби должны пасть на 2-10 сутки после заражения, а иммунизированные - должны выжить в течение 7 суток (срок наблюдения).

Определение концентрации водородных ионов (рН).

Концентрацию водородных ионов в вакцине определяют потенциометрическим методом согласно инструкции приложенной к прибору.

рН вакцины должно быть в пределах 7,0-7,6.

Приготовление живых сухих вакцин

Приготовление питательных сред, хранение и поддержание штаммов, приготовление культур 1 и 2 генерации осуществляется, как указано выше.

Производственное выращивание сальмонелл

Выращенную и проверенную на чистоту матриксную культуру 2 генерации с соблюдением условий стерильности, засевают каждый серовар в отдельный ферментер в стерильную питательную среду (бульон Хоттингера или двухкомпонентная питательная среда), охлажденную до 37°С из расчета 5-6% матриксной расплодки к общему объему питательной основы

Для стимуляции роста культур сальмонелл и биосинтеза специфических антигенов к питательной среде добавляют 50 мг/дм3 сульфата магния, 100 мг/дм3 тиосульфата натрия, 0,08-0,09% 7,5%-ного стерильного раствора левомизола или другие стимуляторы роста.

Культуру, засеянную в ферментер, выращивают 8-9 часов при температуре 36-38°С с постоянным перемешиванием при 60 об/мин и непрерывной аэрации из расчета насыщения одного литра бактериальной суспензии воздухом 1: 1.

Выращенную культуру проверяют на чистоту путем микроскопии и высева в пробирки с МПА, МПБ, МППБ и в чашки Петри с МПА.

При изготовлении вакцины против сальмонеллеза свиней смешивают в равном соотношении монокультуры S. choleraesuis TS-177 и S. typhimurium № 3, а в производстве вакцины против сальмонеллеза молодняка (телят) S dublin № 6 и S. typhimurium № 3.

Составление серии вакцины

Смесь монокультур смешивают с защитной средой в соотношении 1:1.

Среду для высушивания готовят по следующей прописи: в кипящей дистиллированной или деминерализованной воде растворяют желатин 1,5-2%, после чего добавляют 10% сахарозы. смесь кипятят не более 5-6 минут. Устанавливают рН 7,6-7,8 4-10% -ным раствором натрия гидроокиси, фильтруют через полотняный фильтр, разливают по 18-ти литровым бутылям по 12 литров и стерилизуют при температуре 119°С в течение 30 минут. После стерилизации среду высушивания проверяют на стерильность путем высева на МПА, МПБ, МППБ. рН после стерилизации должна быть 6,8-7,2.

Расфасовка вакцины

Расфасовку вакцины производят при непрерывном перемешивании. Флаконы закрывают двойной марлевой салфеткой, подвергают замораживанию и высушиванию.

Замораживание и высушивание

Флаконы с вакциной помещают в кассеты и ставят в морозильную камеру для замораживания при температуре минус 50-60°С в течение 12-24 часов.

После замораживания флаконы с вакциной переносят в сушильные аппараты, предварительно продезинфицированные путем тщательного протирания 700 спиртом и облучения кварцевой лампой 30 минут или фламбирования пламенем большого спиртового факела.

Процесс загрузки должен занимать не более 2-3 минут.

Высушивание производят методом сублимации. Продолжительность сушки устанавливают в зависимости от объема наполнения флаконов. Например, для вакцины во флаконах по 2 см3 продолжительность сушки 48-50 часов, а для вакцины в расфасовке по 4 см3 - 72-78 часов, причем период сублимации (период сушки при минусовых температурах вакцины от минус 50 до 0°С) должен быть в пределах 60% общего времени сушки.

Давление в сушильной камере в период сублимации должно быть не более 0,18 мм рт.ст. В период досушивания вакцины (период повышения температуры от 0 до +30°С) давление должно понижаться и в конце сушки достигать значений 0,1: 0,05 мм рт.ст.

Окончание процесса сушки характеризуется достижением заданной конечной температуры в материале (+30°С), минимальным давлением в камере и их постоянством на протяжении последних часов сушки.

Включение нагрева полок, вакуум-насосы, заполнение камеры азотом, выгрузку сухой вакцины производят в соответствии с заводской инструкцией по эксплуатации сублимационной установки.

Учет производственных процессов

Все работы по изготовлению сухой живой вакцины против сальмонеллеза (паратифа) свиней заносят в специальный пронумерованный, прошнурованный и скрепленный печатью производственный журнал в день их выполнения.

Вакцина живая сухая против сальмонеллеза свиней и телят с растворителем по физическим и иммунобиологическим свойствам должна соответствовать требованиям и нормам, указанным в таблице 1.

Таблица 1.

Требования и нормы, предъявляемые к вакцине живой сухой против сальмонеллеза свиней и телят с растворителем

Наименование показателей Характеристика и нормы
1 2
Внешний вид вакцины сухая масса в виде таблетки
Цвет вакцины беловатый или светло-желтый
Наличие механических примесей и других посторонних включений не допускается
Растворимость вакцины, мин, не более 3
Массовая доля влаги в вакцине, % 1,0-3,5
Контаминация вакцины посторонними микроорганизмами не допускается
Морфология вакцинного штамма на МПА через 24 часа роста образуют бесцветные, прозрачные, гладкие колонии S-формы, а на МПБ через 16-24 часа - равномерное помутнение. В мазках - отрицательная палочка.
Количество живых бактерий во флаконе с вакциной вместимостью 5; 10; 20; 50 см3 должно быть соответственно не менее 5 млрд. микробных клеток

10 млрд. микробных клеток

20 млрд. микробных клеток

50 млрд. микробных клеток

Количество доз во флаконе при расфасовке вакцины по 2,5; 5; 10 и 25 см3 должно быть не менее соответственно 5

10

20

50

Безвредность вакцины Вакцина должна быть безвредной для белых мышей, привитых подкожно в дозе 2 млн.м.к. в объеме 0,5 см3. Допускается гибель 2 животных из 10 иммунизированных в течение 10 суток наблюдения
Иммуногенная активность вакцины Вакцина должна предохранять от гибели не менее 80% иммунизированных животных в каждой группе при гибели в контрольной группе не менее 80% животных
Внешний вид растворителя прозрачная жидкость
Цвет растворителя светло-желтый или темно-желтый
Стерильность растворителя посевы растворителя на питательные среды должны оставаться стерильными
Безвредность растворителя подкожное введение растворителя 5 белым мышам массой 16-18 г в дозе 0,5 см3 не должно вызывать заболевания и гибель животных в течение 10 суток
рН растворителя 6,8-7,6

Контроль сухих живых вакцин против сальмонеллеза свиней и телят

Определение внешнего вида, цвета вакцины, наличия механических примесей и других посторонних включений.

Для определения внешнего вида и цвета все флаконы выборки с вакциной просматривают визуально, одновременно проверяют правильность упаковки и маркировки.

Для определения наличия механических примесей и других посторонних включений содержимое 10 флаконов выборки с вакциной вместимостью 5, 10, 20 и 50 см3 растворяют соответственно в 2,5; 5; 10 и 25 см3 растворителя и просматривают визуально.

Флаконы с вакциной должны быть без трещин, содержать сухую массу в виде таблетки беловатого или светло-желтого цвета. Вакцина должна быть без механических примесей и других посторонних включений.

Определение растворимости вакцины.

В каждый из 5 флаконов выборки с вакциной вместимостью 5, 10, 20 или 50 см3 добавляют соответственно по 2,5; 5; 10 и 25 см3 растворителя.

Вакцина должна раствориться не более чем за 3 минуты с образованием гомогенной взвеси.

Определение массовой доли влаги в вакцине.

Определение показателя производится по ГОСТ 24061-89 “Препараты биологические сухие. Метод определения влажности”.

Массовая доля влаги в вакцине должна быть в пределах 1,0-3,5%.

Определение контаминации вакцины и морфологии вакцинного штамма.

Для проведения испытания используют 5 флаконов выборки с вакциной. Из каждого флакона производят посев в объеме 0,2 см3 в пробирки с МПА, МПБ, средами Китта-Тароцци и Сабуро и по 1 см3 во флаконы с МПБ, средой Китта-Тароцци, 3-4 чашки Петри с МПА по Дригальскому. Посевы на МПА, МПБ и среде Китта-Тароцци выдерживают в течение 24 часов при температуре 36-38°С, на агаре Сабуро - при температуре 18-220 С в течение 10 суток.

В посевах из вакцины не должно быть роста посторонних микроорганизмов. При росте вакцинных штаммов сальмонелл на МПА через 24 часа должны образовываться бесцветные, прозрачные, гладкие колонии S-формы, на МПБ через 16-24 часа - равномерное помутнение.

В мазках из посева вакцины, окрашенных по Граму, должны наблюдаться однородные грамотрицательные палочки, среди которых могут встречаться более крупные, удлиненные бактериальные клетки.

Определение количества живых бактерий и доз во флаконе с вакциной.

Для проведения испытания используют 5 флаконов выборки с вакциной. Содержимое всех пяти флаконов смешивают. Затем из приготовленной объединенной пробы готовят отдельными пипетками разведения вакцины в пробирках растворителем от 10-1 до 10-9. Для этого в пробирки вносят по 4,5 см3 растворителя. Затем в первую пробирку добавляют 0,5 см3 суспензии вакцины, пятикратно пипетируют, отбирают 0,5 см3 содержимого из первой пробирки (первого разведения) и переносят во вторую пробирку с растворителем и т.д. На каждое разведение используют отдельную стерильную пипетку.

Для испытания применяют 2 разведения вакцины - 10-7 и 10-8. Из каждого разведения проводят посевы по 0,1 см3 на поверхность МППА или агара Хоттингера в 3 чашках, предварительно выдержанных при температуре 36-38°С в течение 72 часов. После инкубирования посевов в термостате при температуре 36-38°С в течение 36-48 часов, подсчитывают количество выросших колоний в чашках по каждому разведению. Полученные показатели суммируют и делят на количество чашек Петри, определяя среднее количество живых бактерий для каждого разведения, содержащихся в 0,1 см3. Затем средние показатели по каждому разведению увеличивают в 10 раз, получая количество живых микробных клеток исследуемой вакцины по одному разведению. После этого выводят среднюю концентрацию живых микробных клеток в 1 см3 вакцины, сложив результаты по двум взятым разведениям и разделив их на 2.

Количество живых бактерий во флаконах с вакциной вместимостью 5,0; 10,0; 20,0 и 50,0 см3 должно быть соответственно не менее 5, 10, 20 и 50 млрд. м.к.

Количество доз вакцины устанавливают путем деления показателя количества живых сальмонелл во флаконе с вакциной на количество живых микробных клеток содержащихся в одной дозе.

Одна иммунизированная доза для свиней соответствует 900-1000 млн. живых бактерий (усредненный показатель 950 млн. живых бактерий).

Пример:

В разведении 10-7 в 3-х чашках Петри выросло 660 колоний, следовательно 660: 3 х 10 х 107 = 22 млрд. живых бактерий в 1 см3 вакцины.

В разведении 10-8 в 3-х чашках Петри выросло 6- колоний, следовательно 60: 3 х 10 х 108 = 20 млрд. живых бактерий в 1 см3.

После этого показатели по каждому разведению суммируют и делят на количество испытуемых разведений, определяя средний показатель концентрации сальмонелл в 1 см3 вакцины: (22 млрд. м.к. + 20 млрд. м.к.): 2 = 21 млрд. микробных клеток. При фасовке во флаконы вакцины по 5 см3 соответственно живых микробных клеток будет содержать: 21 млрд. м.к. х 5 = 105 млрд м.к.

Для определения количества доз во флаконе, содержащем 5 см3 вакцины, количество живых бактерий, т.е. 105 млрд.м.к., делят на 950 млн.м.к. (усредненный показатель одной иммунизированной дозы для свиней) = 110 доз. Количество доз во флаконах при фасовке вакцины по 2,5; 5,0; 10,0 и 25,0 см3 должно быть соответственно не менее 5, 10, 20 и 50 доз.

Определение безвредности вакцины.

Для проведения испытания используют 5 флаконов выборки с вакциной. Содержимое всех флаконов объединяют. Объединенную пробу вакцины разводят растворителем до концентрации 4 млн. живых микробных клеток в 1 см3.

Подготовленную вакцину вводят подкожно в область спины 10 белым мышам массой 16-18 г по 0,5 см3 (2 млн. живых микробных клеток) на животное. Наблюдение за животными осуществляют в течение 10 суток.

Вакцина должна быть безвредной для белых мышей. Допускается гибель 2 животных из 10 иммунизированных в течение 10 суток наблюдения.

Определение иммуногенной активности вакцины.

Иммуногенную активность биопрепарата определяют на морских свинках или белых мышах.

Для испытания готовят объединенную пробу вакцины, которую разводят растворителем до концентрации 200 млн. живых бактерий в 1 см3.

Определение иммуногенной активности вакцины на морских свинках. 10 морским свинкам массой 350-400 г вводят вакцину подкожно в области паха по 200 млн. живых бактерий в объеме 1 см3. Через 14-16 суток иммунизированных и не привитых (контрольных) животных, аналогичной массы, заражают подкожно культурами вирулентных штаммов: Сальмонелла тифимуриум № 371, Сальмонелла суис № 370 (при испытании сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней) и Сальмонелла тифимуриум № 371, Сальмонелла дублин № 373 (при испытании вакцины против сальмонеллеза молодняка) в ЛД50 дозе - по 5 опытных и контрольных животных каждым сероваром. Наблюдение за животными осуществляют в течение 10 суток от момента гибели 50% контрольных животных.

Определение иммуногенной активности вакцины на белых мышах. 20 белых мышей массой 16-18 г вакцинируют подкожно в области спины в дозе по 2 млн. живых бактерий в объеме 0,5 см3 на одно животное. Через 14-16 суток иммунизированных белых мышей и 20 непривитых (контрольных), аналогичной массы, заражают подкожно культурами вирулентных штаммов: Сальмонелла суис № 370, Сальмонелла тифимуриум № 371 (при испытании сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней) и Сальмонелла дублин № 373, Сальмонелла тифимуриум № 371 (при испытании вакцины против сальмонеллеза молодняка) в ЛД50 дозе - по 10 опытных и контрольных животных каждым сероваром. Наблюдение за животными осуществляют в течение 10 суток от момента гибели 50% контрольных животных.

Вакцина должна предохранять от гибели не менее 80% иммунизированных морских свинок и белых мышей в каждой группе при условии гибели в контрольной группе не менее 80% животных.