Методы селекции

Результативность селекции в первую очередь зависит от применяемых методов. К настоящему времени наиболее распространенными являются методы отбора и гибридизации. Кроме того, в последние годы активные работы ведутся по разработке методов полиплоидии, мутагенеза, культуры изолированных клеток и тканей, клеточной и генной инженерии.

Отбор

В основе селекционной работы в любом направлении отбор является наиболее важным и решающим процессом все сорта сельскохозяйственных культур созданы и создаются отбором.

Улучшение древесных и кустарниковых пород путем выявления, отбора и размножения ценных популяций и форм является основным методом лесной селекции.

В лесной селекции выделяют три типа отбора: массовый, групповой и индивидуальный.

Массовый отбор, или отбор, лучших климатических экотипов (отбор по происхождению), является простейшим методом селекции, который положен в основу районирования переброски семян лесных древесных растений. При помощи географических культур установлено большое влияние происхождения семян на рост и качество лесных насаждений сосны, ели, дуба, лиственницы и других видов древесных растений как в пределах естественного ареала, так и при интродукции. На первом этапе искусственного отбора выгодно исходить из местной, или локальной, расы (популяции), которая под действием естественного отбора приобрела полезные приспособления к окружающим условиям.

Групповой отбор лучших местных популяций становится основой лесной селекции. Этот вид отбора высококачественных насаждений, популяций лесных древесных пород называют популяционным отбором.

Индивидуальный отбор – это отбор лучших биотопов, или клонов, а также ценных форм в популяциях и экотипах. Индивидуальный отбор плюсовых деревьев по фенотипу без проверки по потомству соответствует однократному массовому отбору в сельском хозяйстве. Отбор лучших особей в ряду поколений сельскохозяйственных растений получил название непрерывного массового отбора. Разновидностью непрерывного массового отбора является негативный отбор, при котором отбираются не лучшие растения, а удаляют из насаждения худшие особи. В лесоводстве процесс негативного отбора осуществляется рубками ухода и санитарными рубками, при которых вырубаются худшие по селектируемому признаку и больные растения.

Отбор по фенотипу дает хорошие и быстрые результаты в том случае, когда его задачи совпадают с направлением естественного отбора в данных условиях. Например, если в популяциях имеются рано распускающиеся формы и этот признак в данной местности определяет лучшее вызревание побегов и улучшает общий прирост древостоев, то отбор по началу и продолжительности вегетации может быть эффективным. Но в селекции на улучшения качества продукции возможности отбора по фенотипу часто очень ограничены. Таким образом, аналитическая селекция и создание новых форм при помощи других методов значительно облегчаются при совпадении направлений естественного и искусственного отборов. В популяциях лесных древесных растений наблюдаются три основных формы естественного отбора: направленный, стабилизирующий и дизруптивный.

Направленный отбор - из популяции в процессе развития древостоев отмирает один из генотипов с положительным или отрицательным отклонением значения признака от среднепопуляционного. Направленный отбор у лесных древесных пород с отпадом в онтогенезе отстающих по росту особей наиболее характерен для признака продуктивности по высоте.

Стабилизирующий отбор наблюдается при пониженной адаптивности ценности признака, когда в популяции отмирают особи, имеющие генотипы с крайними отклонениями признака (возрастает частота гетерозигот). Например, превалирования прироста гетерозиготных особей в раннем возрасте у ели, березы и других пород.

Дизруптивный отбор – определенные преимущества имеют оба генотипа с крайними отклонениями признака. В зависимости от типа скрещивания между ними возникает различное распределение генотипов.

Основными методами индивидуального отбора являются методы: клоновый отбор, отбор у перекрестноопыляющихся растений и метод педегри.

Индивидуальный отбор в селекции растений, размножаемых вегетативно, называется клоновым. Индивидуальный отбор у перекрестного опыляющихся растений, вследствие постоянного переопыления и расщепления признаков сортов у перекрестноопыляющихся растений нельзя вывести путем однократного индивидуального отбора. Поэтому в селекции таких растений применяется многократный или непрерывный (в каждом поколении) индивидуальный отбор. При этом имеют дело не с отдельным растением, а с семьями.

Индивидуально-семейный отбор заключается в том, что после отбора лучших растений в популяции исходного материала потомство каждого лучшего растения, называемого семьей, размещают изолированно от остальных потомств (Царев и др., 2001).

Гибридизация

Гибридизация – скрещивание между собой двух или большего числа видов, наследственно различающихся по какому-либо признаку или группе признаков.

Гибрид – потомство, полученное в результате скрещивания особей с разной наследственностью.

Скрещивание особей разных форм и сортов, принадлежащих к одному виду, называется внутривидовой гибридизацией.

Скрещивание особей, принадлежащих к разным видам одного рода, разным родам и разным семействам, называется межвидовой, межродовой и межсемейственной гибридизацией.

Гетерозис – увеличение мощности и жизнеспособности гибридов, по сравнению с родительскими формами.

Искусственная гибридизация – контролируемое скрещивание, которое проводится с целью получения семенного потомства, отличающегося хозяйственно-ценными признаками.

При гибридизации:

1) подбирают родительские пары для скрещивания (чтобы каждый из родителей обладал одним из признаков, которые необходимо получить в гибриде)

2) наблюдают за протеканием репродуктивной фазы у родительских особей

3) собирают пыльцу, определяют ее жизнеспособность

4) проводят искусственное опыление

5) наблюдают за развитием гибридных семян

6) собирают гибридные семена, высеивают и выращивают гибридное потомство

7) отбирают среди гибридов экземпляры по селектируемым признакам.

В зависимости от принципа подбора родительских пар различают типы скрещиваний:

- простые – однократные скрещивания между двумя родительскими формами

- парные – однократное скрещивание только между двумя родительскими формами

- диаллельные – каждая испытываемая форма или вид скрещивается со всеми другими формами или видами во всех возможных комбинациях

- реципрокные – каждый из двух форм или видов в одном случае является материнской формой, во втором отцовской

- сложные – если скрещивается более двух родительских форм или гибридное потомство повторно скрещивается с одним из родителей

- множественные (поликросы) – материнское растение опыляется смесью пыльцы нескольких видов

- возвратные (беккроссы) – гибрид повторно скрещивается с одной из родительских форм

- ступенчатые – полученный от простого скрещивания гибрид скрещивается не с родительской формой, а с третьим видом, затем с четвертым

- конвергентные – скрещивание гибридов от материнской и отцовской форм

- межгибридное – объединение наследственности нескольких родителей при скрещивании гибридов от параллельного скрещивания (Любавская, 1985).

Мутагенез

Мутации - это прерывистые, скачкообразные изменения наследственных структур, возникающие под влиянием факторов среды. Изменчивость, обусловленная возникновением мутаций, называется мутационной. Растения с мутировавшими клетками называются мутантами.

Мутации классифицируют по различным признакам. В зависимости от того, на каком уровне они возникают и какие генетические структуры затрагивают, различают мутации генные, хромосомные, геномные, пластидные и плазменные.

Генные мутации представляют собой наследственные изменения, связанные с появлением новых аллелей. Они возникают на уровне нуклеотидов в результате потери или удвоения, изменения порядка чередования или вставки одного или нескольких нуклеотидов в молекулах ДНК в ядре. Так как фиксированных границ между триплетами не существует, все перечисленные изменения в молекулах ДНК приводят к изменению порядка "считывания" наследственной информации, заключенной в этих молекулах.

Хромосомные мутации возникают вследствие разрывов хромосом. Оторванная часть хромосомы (фрагмент) может присоединиться к той же или любой другой хромосоме или элиминируется в процессе деления клетки. Потеря части хромосомы называется делекцией, удвоение одного и того же участка хромосомы — дупликацией, поворот в пределах одной хромосомы какого-то участка ее на 180° получил название инверсия, а присоединение фрагмента к другому месту той же или другой негомологичной хромосомы — транслокации. Перестройки, захватывающие всю хромосому, называются хромосомными, а хроматиду — хроматидными (Котов, 1997).

Геномные мутации связаны с изменением числа хромосом в клетке.

Плазменные мутации представлены изменениями наследственных структур в цитоплазме, а пластидные — в пластидах. Они изучены пока недостаточно полно.

Элементарной единицей мутации считается мутон, равный одному нуклеотиду.

Мутации возникают в природе и могут быть вызваны искусственно. Первые называются спонтанными (естественными), а вторые — индуцированными (искусственными). По своей природе мутации естественного происхождения и полученные искусственно не отличаются.

Мутации, возникающие в гаметах, называются гаметическими, а в клетках тела - соматическими. Если мутировавшая гамета участвует в оплодотворении и образовании зиготы, то все клетки организма, вырастающего из такой зиготы, будут мутировавшими. Соматическая мутация передастся только тем клеткам организма, для которых в качестве исходной материнской служила соматическая мутантная клетка. Таким образом возникает химерный организм, состоящий из клеток с неодинаковой генетической информацией.

По характеру фенотипического проявления различают мутации морфологические, если изменение затрагивает морфологические признаки, физиологические и биохимические. В последних двух случаях изменения касаются физиологических и биохимических процессов. Строго говоря, любые изменения морфологических признаков или функциональных особенностей происходят через изменения биохимических процессов (Котов, 1997).

В большинстве случаев мутации снижают жизнеспособность мутировавшей клетки и организма. Такие мутации называются вредными. Крайним выражением действия вредных мутаций является гибель мутанта. В таких случаях мутация называется летальной. Мутации, не вызывающие заметных сдвигов в жизнеспособности организмов, — нейтральные. Часть мутаций способствует усилению жизнеспособности организмов. Это — биологически полезные мутации. Их нельзя отождествлять с хозяйственно полезными мутациями, вызывающими усиление признаков, используемых человеком для удовлетворения своих нужд. Нередко улучшение "хозяйственного" признака сопровождается ослаблением конкурентной способности организма. Естественный отбор такие мутанты элиминирует, а человек отбирает и разводит в культуре. Любая мутация может наследоваться, так как она возникает в наследственных структурах клеток. Характер наследования зависит от природы мутаций, хотя в основе лежат общие закономерности, связанные с их наследованием.

Факторы, вызывающие изменения в молекулах ДНК или хромосомах, называются мутагенными. Мутагенными свойствами обладают такие физические факторы как ионизирующая радиация, ультрафиолетовые лучи, температурные шоки, лазерное излучение, а также многие химические соединения.

В настоящее время в мутационной селекции наибольшее применение находят ионизирующие излучения, которые по своей природе подразделяются на волновые и корпускулярные. К волновым излучениям относятся ультрафиолетовые лучи (длина волны 2000-4000 а), рентгеновы лучи (0,05 - 10 а) и гамма-лучи (менее 0,05А). К корпускулярным излучениям относятся а-частицы, протоны, нейтроны, дейтроны и др.

В основе оценки чувствительности к мутагену лежит общая закономерность, известная под названием закона Арндта-Шульце. Суть его заключается в том, что слабое воздействие мутагеном способствует стимуляции процессов жизнедеятельности растений. По мере усиления воздействия мутагеном стимулирующий эффект возрастает и достигает своего предела, затем постепенно падает и снижается до нуля, после чего переходит в свою противоположность, то есть начинает подавлять процессы жизнедеятельности и тем больше, чем сильнее действие мутагенов. Подавляющее воздействие мутагенов постепенно возрастает вплоть до полной гибели клеток, органа или всего растения. Схематически закон Арндта-Шульце представлен на примере отзывчивости желудей дуба черешчатого на рентгеново облучение.

Различают стимулирующие, критические, летальные и оптимальные дозы мутагенов. Дозы мутагена определяются мощностью источника излучения или концентрацией его (для химических мутагенов) и продолжительностью воздействия на растения, или экспозицией.

Единицей дозы облучения волновыми излучениями служит рентген, равный количеству излучения, при котором в 1 см3 сухого воздуха при 00С и давлении 760 мм рт. ст. образуется 2,1*109 дар ионов. Доза нейтронов определяется их количеством, приходящимся на 1 см2 облучаемой поверхности. 1000 рентген (р) равны 1 килорентгену (кр).

Сравнимость доз облучения достигается при их переводе в дозы поглощения. Единицей дозы поглощения является 1 рад., равный количеству излучений, эквивалентному поглощению 1 граммом вещества энергии в 100 эрг. 1 рад соответствует 1,07 рентгена.

Стимулирующими называются дозы, при которых наблюдается совершенствование процессов жизнедеятельности у обрабатываемых растений в сравнении с контролем, например, повышение всхожести семян, ускорение роста, увеличение урожая и т.д.

Дозы, при которых всхожесть семян составляет около 50% от контроля, а выживаемость — 20-30% от числа всходов, называются критическими.

Дозы, вызывающие гибель обрабатываемого материала, называются летальными, а дозы, при которых на единицу выживаемости растения получается наибольшее количество мутаций, — оптимальными.

При оценке чувствительности растения к мутагенам учитываются такие признаки, как энергия прорастания семян, их всхожесть, выживаемость растений, степень подавления роста, плодовитость и стерильность растения, число и типы хромосомных перестроек в первом митозе в клетках проростков.

Существенные изменения в реакции организма на облучение вносят технические условия обработки: вид излучения, мощность и величина дозы, содержание кислорода при облучении и после него.

Сходная картина наблюдается при обработке растений химическими мугагенами.

Постановка задач при селекции методом индуцированного мутагенеза исходит из направлений селекции и района работы. Растения подбирают, как правило, с минимальным числом отрицательно выраженных признаков, которые подлежат улучшению посредством мутагенеза. В качестве растительного материала для получения гаметических мутаций берут пыльцу, срезанные до споро- или гаметогенеза ветви с пестичными или тычиночными цветками, а также целые растения. Для получения соматических мутаций используют семена, черенки с вегетативными почками, целые растения. Растительный материал подбирают в таком физиологическом состоянии, чтобы при имеющихся в распоряжении селекционера технических возможностях было бы возможно выращивание растений из обработанного мутагенами материала.

Выбор мутагенов зависит от применяемых доз и практической их доступности. В районных центрах и поселках, где есть лечебные учреждения с терапевтической рентгеновской установкой, доступны ультрафиолетовые лучи для работы с пыльцой и каллусными тканями, а также рентгеновы лучи для работы с пыльцой, семенами, черенками. В областных центрах и крупных городах, где есть онкологические отделения, вполне реально использование гамма-лучей кобальтовых пушек. Не является проблемой приобретение в лесничества или лесхозы гупосов (гамма-установок предпосевной обработки семян), химических мутагенов и элементарного оборудования для работы с ними.

Обработка растений корпускулами пока возможна только в ядерных колонках нескольких научно-исследовательских центров. Функционируют международные центры по мутагенезу с гамма-полями. Для выбора рабочих доз обработки растительных объектов необходимо располагать информацией о чувствительности растений к мутагену. Если такой информации нет, то предварительно экспериментальным путем следует установить области стимулирующих, нейтральных, оптимальных, критических и летальных доз. В дальнейшем в целях получения большего количества точковых мутаций следует работать в области стимулирующих и нейтральных доз. Если нужно получить хромосомные и хроматидные мутации, рекомендуется работать в области оптимальных и критических доз.

В работе с химическими мутагенами пользуются 0,00001-0,01%-ми концентрациями растворов. Обязательны меры предосторожности в работе со всеми мутагенами.

Обработанный мутагенами материал используется далее или для скрещивания, или для посадки, прививки, посева. Организуются наблюдения за опытными и контрольными растениям. Ведется журнал селекции, где отмечаются все характеристики исходного материала (вид; внутривидовой таксой; адрес и условия произрастания; какой орган обработан; когда, где и как заготовлен и хранился исходный материал; когда, чем, как обработан; что сделано после обработки; результаты наблюдений).

Перспективные гаметические и соматические мутанты могут быть сразу отобраны. В таких случаях они поступают на сортоиспытание.

Если же наряду с полезными мутанты несут отрицательные изменения, то их скрещивают с ценными видами или формами или повторно обрабатывают мутагенами, а затем уже производят отбор и испытание представляющих интерес мутантов.

Как уже отмечалось, соматические мутации могут возникать не во всех клетках обрабатываемого растения, а только в некоторых из них. В этих случаях растения оказываются химерными. Как правило, измененные клетки делятся медленнее нормальных, что приводит к постепенному вытеснению мутантных тканей нормальными. Это явление получило название соматического отбора» Для выявления скрытых соматических мутаций применяются специальные приемы расхимеривания. У древесных видов расхимеривание можно провести путем одной или многократной посадки опытного растения на пень и последующего отбора мутантных порослевин, черенкования отдельных частей растения, прививки черенков и почек, микроклонального размножения (Котов, 1997).

Для получения мутанта лиственницы сибирской следует взять семена в количестве 50000 шт. и обработать рентгеновым излучением 4000 рентген. В результате облучение половина семян погибла, остальные 25000 семян высеивают и ухаживают за ними до самой смерти. Лучшие мутанты в количестве 5000 шт. отбирают и размножают.

Полиплоидия

Полиплоидией называется биологическое явление, характеризующееся нетипичным числом хромосом в клетках. Растения с нетипичным числом хромосом в клетках называются полиплоидами. Они подразделяются на эуплоиды и анэуплоиды. Эуплоиды — это растения с числом хромосом, кратным основному (гаплоидному) набору. Если, например, у березы основное число хромосом равно 14, то типичными являются гаметы с 14, а соматические клетки с 28 хромосомами. Гаметы с 28, 42, 56 хромосомами будут нетипичными, полиплоидными или нередуцированными. Соматические клетки с 14 хромосомами называются гаплоидными, с 42 - трипловидными, 56 - тетраплоидными и т.д. Если в клетках увеличивается число геномов одного вида, растения называются автополиплоидами. Например, у осины есть автотриплоиды с тремя наборами геномов в клетках (Зn). Число хромосом в них 57, так как в геноме 19 хромосом. Если растения представляют собой гибриды между двумя видами и в клетках содержится не по одному геному каждого вида, а по крайней мере по два генома хотя бы одного вида, они называются аллополиплоидами. Например, среди растений тополя сереющего встречаются триплоиды. В клетках таких растений содержится по три генома, один из которых представлен геномом осины, а два — геномом тополя белого или наоборот.

Растения, в клетках которых содержится число хромосом некратное основному (гаплоидному), называются анэуплоидами. Например, вяз мелколистный имеет 14 хромосом в основном наборе. В степях Северного Казахстана обнаружены растения с 29 хромосомами в соматических клетках. Они имели два набора хромосом (2п=28) и одну добавочную хромосому.

Полиплоиды возникают разными путями. Один из них — нарушение сократительной функции ахроматинового веретена при митозе или мейозе. Вследствие этого хромосомы или хроматиды теряют ориентацию при расхождении к полюсам и в дочерние клетки может отойти число хромосом от 0 до 2п независимо от способа деления (митоз или мейоз), от стадии формирования спор и гамет. Клетки с несбалансированным числом хромосом (не кратным основному) характеризуются слабой жизнеспособностью.

В природе встречаются такие деления, как кариокинез без цитокинеза и удвоение хромосом без последующего деления ядра (эндомитоз). В обоих случаях возникают полиплоидные клетки.

Полиплоиды могут быть и комбинативного происхождения, когда зигота образуется от слияния гамет с разным набором геномов. Слияние гаплоидной и диплоидной гамет дает триплоидную зиготу, двух диплоидных — тетраплоидную и т.п.

Анэуплоиды возникают, как правило, вследствие воздействия на растения мутагенов. Например, в процессе репарации разорванных хромосом возникают ацентрические и дицентрические хромосомы. Первые образуются при объединении фрагментов, не имеющих центромеры. При делении клетки такая хромосома теряется. Дицентрические хромосомы возникают при срастании двух фрагментов с центромерами, которые образуют в анафазе так называемые мосты и далее или снова разрываются, или превращаются в кольцевые хромосомы, которые в клетке не элиминируются (Котов, 1997).

Для получения полиплоида лиственницы сибирской рекомендуется взять 20000 семян, произвести намачивание семян в 0,1%-ном растворе колхицина. Продолжительность действия 18 часов. После этого промывают проточной водой. Затем высеивают, после появления всходов обследуют на появление полиплоидов. Полиплоиды оставляют на контроль, а остальные оставляют и сравнивают с контролем.

Генная инженерия

За последние 10—15 лет были созданы принципиально новые методы манипулирования с нуклеиновыми кислотами in vitro, на основе которых зародился и бурно развивается новый раздел молекулярной биологии и генетики — генная инженерия. Принципиальное отличие генной инженерии от использовавшихся ранее традиционных приемов изменения генотипа (например, создания полиплоидных форм растений) состоит в том, что она дает возможность конструировать функционально активные генетические структуры in vitro в форме рекомбинантных ДНК. Понятия «генная» и «генетическая» инженерия часто употребляют как синонимы, хотя последнее является более широким и включает манипулирование не только отдельными генами, но и с более крупными частями генома. Работа по переделке генотипа животных или растений с помощью скрещиваний ограничены пределами вида либо близких в видовом отношении форм. Напротив, генная инженерия, как будет показано ниже, стирает межвидовые барьеры, обеспечивая возможность создания организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. Генная, инженерия представляет собой совокупность методов, позволяющих не только получать рекомбинантные ДНК из фрагментов геномов разных организмов, но и вводить такие рекомбинантные молекулы в клетку, создавая условия для экспрессии в ней введенных, часто совершенно чужеродных генов. Таким образом, в этом случае исследователь оперирует непосредственно с генами, причем их перенос может не зависеть от таксономического родства используемых организмов. Эта особенность генной инженерии представляет ее главное отличие от ранее использовавшихся приемов изменения генотипа.

Первенствующую роль в формировании генной инженерии сыграла генетика микроорганизмов, идеи и методы, разработанные молекулярной генетикой и химией нуклеиновых кислот.

Выполнение любой генно-инженерной программы включает необходимость получения фрагментов ДНК, несущих нужный ген, объединение их in vitro с век-торными молекулами, способными обеспечить доставку гена в организм реципиента, создание условий для стабильного наследования и эффективной экспрессии перенесенного гена. Осуществление такой работы определяется крупными достижениями в области генетики и химии нуклеиновых кислот. К важнейшим из них относятся:

1) открытие явления рестрикции-модификации ДНК, в результате которого были выделены необходимые ферменты — рестриктазы для получения специфичных фрагментов ДНК;

2) создание методов химического и химико-ферментативного синтеза генов;

3) выявление векторных молекул ДНК, способных перенести в клетку чужеродную ДНК и обеспечить там экспрессию, соответствующих генов;

 4) разработка методов объединения фрагментов ДНК из разных источников;

5) разработка методов трансформации у различных организмов и отбора клонов, несущих рекомбинантные ДНК.

Совокупность этих достижений и составляет сущность методологии генной инженерии.

Не менее важное значение имеет генная инженерия в качестве мощного инструмента фундаментальных исследований. С ее помощью изучают строение различных геномов, отдельных генов и кодируемых ими продуктов. Генная инженерия помогла раскрыть экзонинтронную организацию эукариотических генов, позволяла понять суть явления непостоянства генома, связанного с присутствием мигрирующих генетических элементов у про- и эукариот, открыла принципиально новые возможности для изучения молекулярных основ онтогенеза, наследственных заболеваний, эволюционного происхождения различных организмов. В значительной мере этим успехам генной инженерии способствовало создание банков (или библиотек) генов отдельных организмов, резко облегчающих стратегию поиска индивидуальных генов, исследование их структуры и функции. Получение танков генов включает выделение тотальной ДНК, фрагментацию ее с помощью рестриктаз, присоединение полученных фрагментов к векторным молекулам (плазмидного или фагового происхождения) и введение рекомбинантных ДНК в реципиентные бактерии. Эта техника позволяет получить набор клонов бактерий или щтоков гибридных фагов, различающихся по включенным фрагментам ДНК. Необходимые исследователю гены отбирают из таких банков с помощью специально разработанных генетических, биохимических, радиоизотопных и иммунологических методов. Потенциальные возможности генной инженерии действительно очень велики, и их реализация в полной мере дело сегодняшнего дня и ближайшего будущего (Котов, 1997).

С помощью генной инженерии лиственнице сибирской можно пересадить ген лимонника китайского, тем самым создать стелющуюся форму лиственницы. Затем провести наблюдение в течение всей жизни.