Применения метода непрямого электрохимического окисления в ветеринарии

Эволюция сформировала две мощные защитные системы в организме животных и человека — филогенетически более древнюю монооксигеназно- детоксикационную систему печени и иммунную систему, которые находятся в тесной связи с экскреторной системой.

Гидрофобные ксенобиотики и эндогенные токсины в монооксигеназной системе, окисляясь на цитохроме Р-450, трансформируются в гидрофильные и выводятся из организма экскреторными органами. Недоокисленные на цитохроме Р-450 метаболиты, соединяясь с белками и аминокислотами, образуют гаптеновые группировки, обладающие антигенными свойствами, которые дополнительно включают иммунную систему в процесс элиминации. Кроме того, в детоксикацию активно включаются неспецифические факторы иммунитета, а именно микро- и макрофаги, которые после адгезии бактерий, вирусов и других компонентов на мембранах выделяют Cl-, BrO-, IO-, осуществляя микросомальное окисление.

Фактически все желудочно-кишечные болезни молодняка животных сопровождаются развитием в той или иной степени интоксикационных процессов, а печень в данной ситуации, есть естественный и основной барьер на пути поступления образующихся токсических веществ из пищеварительного тракта в общий кровоток и предупреждающий генерализацию интоксикации. В связи с этим поиск возможных путей моделирования естественных процессов обезвреживания токсинов в печени представляется на наш взгляд актуальным и целесообразным. Литературных данных касательно данных вопросов крайне недостаточно, они разрозненны, а иногда и противоречивы, что явилось причиной необходимости концептуального освещения данной информации в настоящем пособии.

Принципиальных отличий в механизмах детоксикации экзогенных и эндогенных токсических веществе, вероятно, не существует.

В биологической литературе хорошо известен механизм естественной детоксикации токсических соединений. Так, «судьба» попавших в организм ксенобиотиков, либо токсинов эндогенного происхождения, во многом зависит от степени их гидрофобности. Если это полярное соединение, то его выведение может быть не сопряжено с процессами биотрансформации. Однако, если токсическое вещество представляет собой достаточно гидрофобное соединение, то для эффективного удаления из организма необходимо его превращение в более полярные продукты, как, например, окисление в печени на цитохроме Р- 450 (А. И. Арчаков, 1975; В. М. Щербаков, А. В. Тихонов, 1995; D. Kishimoto, A. Oku., D. Kurihara, 1995).

В настоящее время данный механизм, с помощью которого печень обезвреживает ядовитые соединения гидрофобной природы, попадающие в организм извне достаточно известен. Основной реакцией детоксикации в печени является реакция окисления ксенобиотиков на цитохроме Р - 450 — специальном детоксицирующем ферменте (E.W. Justi, A.W. Winsel, 1962). Биохимический смысл реакции заключается в том, что окисленное соединение всегда лучше растворимо в воде, поэтому оно может быть гораздо легче, чем исходное вещество, вовлечено в другие метаболические превращения или выведено из организма экскреторными органами.

Простейший детоксицирующий цикл осуществляется всего двумя биомолекулами — альбумином и цитохромом Р - 450. Альбумин выполняет транспортную функцию, цитохром Р - 450 — окислительную. Попавшие в организм извне гидрофобные вещества соединяются с альбумином и в виде комплекса транспортируются в печень. Часть вещества может попадать в печень и в свободном виде. В ней на цитохроме Р-450 в мембранах эндоплазматической сети гепатоцитов происходит окисление ксенобиотиков; они в виде комплекса или в свободном виде поступают B экскреторные органы и удаляются.

Следовательно, именно фермент Р - 450 можно считать основной де- токсицирующей системой печени. Однако этот фермент действует не самостоятельно, а в составе окислительно-восстановительной ферментной цепи, поставляющей на него электроны, необходимые для активации молекулярного кислорода. Гидроксилирующие ферментные системы, использующие в качестве окислителя молекулярный кислород, требуют для своего функционирования пиридиннуклеотиды NADP и NADH. Эти ферменты внедряют один атом кислорода в субстрат и восстанавливают другой атом кислорода до воды. В общем виде реакции окисления с участием монооксигеназ характеризуются следующей стехиометрией:

RH + NADP-H (NADH) + H+ + O2 2-450 ROH + NADP+/NAD++ H2O (1).

Таким образом, мы имеем дело с гидроксилирующим окислением молекулярным кислородом, катализируемым цитохромом Р-450 (А. К. Мартынов, В. И. Сергиенко, Ю. М. Лопухин и др., 1985). До сих пор окончательно не решен вопрос о механизме активации молекулярного кислорода цитохромами Р-450 и неизвестны природа и строение гидроксилирующего агента (Д. И. Метелица, 1982). Однако это не может служить препятствием для поиска простых каталитических или электрохимических систем, способных заменить уникальный гемопротеид, цитохром Р-450, и вызвать процессы окисления, не уступающие по своей эффективности и селективности ферментативным.

Электрохимический принцип лежит в основе абсолютного большинства, если не всех, процессов жизнедеятельности организмов. Это универсальный принцип живой природы.

Поэтому, электрохимические методы моделирования гидроксилазных реакций, происходящих в микросомах печени вследствие своей физиологичности, привлекли наше особое внимание.

Впервые идея моделирования детоксицирующей функции печени с помощью электрохимического окисления была выдвинута в 1975 г. S. J. Yao, S. К. Wolfson, которые предложили удалять избыток таких веществ, как аммиак, мочевина, мочевая кислота, лекарственные гликозиды, окись углерода, барбитураты, кетоны, ацетоацетат, метанол, креатинин, анилин, этанол, из крови или других биологических жидкостей во вживляемой или действующей в экстракорпоральном шунте электрохимической ячейке. Эти авторы рассмотрели работу таких ячеек по принципу топливного элемента, когда на катоде происходит электровосстановление газообразного кислорода или кислорода, растворенного в крови больного, а на аноде — окисление токсинов, как и при подключении внешнего постоянного тока, когда он является источником электродвижущей силы. Цитируемые авторы предложили окислять мочевину в диализате при помощи электрохимических методов. Ориентируясь в основном на топливные элементы, т. е. на электрокаталитические системы, эти авторы предполагали возможность электроокисления токсинов при низких анодных потенциалах на электродах-катализаторах с высокоразвитой поверхностью.

Примерно в то же время в СССР Ю. М. Лопухин, А. И. Арчаков и их сотрудники создали электрохимическую модель цитохрома Р-450, а также детоксикационно-экскреторную систему, состоящую из реактора окислителя и диализатора. В простой электрохимической системе гидрофобные вещества окислялись молекулярным кислородом, восстанавливаемым на катоде. Этот электрохимический реактор моделировал окислительную функцию печени, а диализатор — экскреторную функцию почек.

Однако, несмотря на большой интерес к методу электрохимического окисления, он не находил клинического применения, так как в первых исследованиях рассматривалась лишь принципиальная возможность детоксикации организма прямым электроокислением крови и других биологических жидкостей.

Экспериментально исследовалось электроокисление на платиновом аноде различных типичных токсинов в фосфатных буферных растворах и в изотоническом растворе хлорида натрия. Было показано, что в обоих случаях в основном происходит прямое электроокисление молекулы токсина на поверхности электрода, обычно протекающее через стадию гемосорбции. На платиновом электроде электроокисление осуществляется как путем перехода электрона в замедленной стадии (окисление билирубина в биливердин) с последующим депротонированием или гидроксилированием, так и — наиболее часто — электрокаталитически, с участием адсорбированных радикалов (ОНадс) и гемосорбированных частиц токсинов (окись углерода, метанол, барбитураты, этанол и др.). Окисление почти всех изученных веществ, за исключением мочевины и уксусной кислоты, происходит на платиновом электроде при потенциалах до начала выделения кислорода. Эти результаты исключают возможность заметного вклада в процесс окисления промежуточно образующихся при выделении кислорода радикальных частиц и активного атомарного кислорода. Еще меньшую роль в процессе окисления токсинов играет молекулярный кислород, пересыщающий приэлектродный слой при его выделении. Исследования электроокисления в изотоническом растворе хлорида натрия на платиновом электроде показали, что в большинстве случаев роль процессов опосредованного окисления токсинов образующимися на электроде устойчивыми окислителями (в изотоническом растворе: гипохлоритом натрия, хлором) также незначительна, хотя при переходе от одного вещества к другому несколько изменяется.

Проводились исследования по электроокислению токсинов на электродах из различных материалов (стекло-углерод, сталь, никель, графит и различные углеграфитовые материалы, в том числе и активированный уголь), однако большинство типичных токсинов с заметной скоростью окисляется только на электродах-катализаторах из металлов платиновой группы. Платиновый электрод является наиболее подходящим катализатором для моделирования цитохрома Р-450, так как на нем окисляются практически все токсины.

Кровь, плазма, лимфа представляют собой негомогенные и очень сложные многокомпонентные системы. Поэтому при изучении крови и других биологических жидкостей разработчики метода прямого электрохимического окисления столкнулись с рядом серьезных проблем.

Первая из них — работоспособность электрохимической ячейки в крови или другой биологической жидкости. При контакте электродов электрохимической ячейки с кровью поверхность электродов быстро покрывается белками и разрушенными форменными элементами. Вследствие блокады поверхности электродов прекращается прохождение электрического тока через ячейку и процесс электроокисления токсических веществ полностью останавливается. Для предотвращения этого были предложены метод вибрирующих электродов (Ю. М. Лопухин, А. И. Арчаков, Г. Ф. Жирнов и др., 1983) и метод электроокисления в кипящем слое (А. К. Мартынов, В. И. Сергиенко, Ю. Б. Васильев, В. А. Гринберг, 1985). Вибрация электродов при работе в биологической жидкости препятствует образованию на поверхности электрода конденсированной пленки из белков и форменных элементов крови и обеспечивает нормальное протекание тока через электрохимическую ячейку.

Метод электроокисления в кипящем слое заключается в том, что процесс проводится при высоких плотностях тока, когда основная его часть затрачивается на электролиз воды с выделением кислорода и водорода. Выделяющиеся пузырьки газов создают у электродов кипящий слой, препятствующий образованию на поверхности электрода конденсированной пленки из белков и форменных элементов.

Вторая проблема связана с так называемым эффектом белковой защиты. Было обнаружено, что при переходе от окисления токсина в модельном (изотоническом) растворе хлорида натрия к окислению токсина, содержащегося в реальной биологической жидкости, наблюдается резкое снижение парциальной скорости окисления. При одной и той же токовой нагрузке на электрохимическую ячейку часто выявляется, что токсин практически перестает окисляться (особенно в отсутствии ионов хлора). При этом было отмечено, что, хотя токсичный компонент и окисляется в хлоридных растворах, окисление происходит в основном не непосредственно на электроде, а опосредованно, так как вблизи электрода в результате электрохимического процесса образуется окислитель в значительных концентрациях — гипохлорит натрия.

Как показали результаты специальных исследований, такое уменьшение скорости окисления объясняется связыванием токсинов с альбумином с образованием комплекса, не подвергающегося прямому окислению на электроде. Белковая молекула препятствует подходу к поверхности электрода и адсорбции на ней ксенобиотика и его прямому окислению.

Это свидетельствует о том, что молекулы билирубина, прочно связанные с альбумином, экранируются им и не подвергаются окислению. При этом изменяется механизм окисления — оно в значительной степени становится опосредованным. На поверхности электрода основным электрохимическим процессом становится разряд ионов хлора.

Таким образом, «эффект белковой защиты» является важнейшим фактором, который необходимо учитывать при разработке любого способа де- токсикации и выведения ксенобиотиков и эндогенных соединений гидрофобной природы. Прямое электроокисление тоже резко замедляется и не может преодолеть белковую защиту.

Третья проблема — совместимость электрохимической ячейки с кровью. Основным травмирующим кровь фактором является не вибрация электродов и не соприкосновение крови с материалами электрохимической ячейки, а собственно прохождение электрического тока через кровь. Травмирующее воздействие электрического тока на кровь связано:

а) с электрофорезом форменных элементов, белков и других заряженных компонентов крови под действием межэлектродного электрического поля;

б) с прямым переходом электрона при подходе форменного элемента к электроду, т. е. с электрическим пробоем мембраны;

в) с изменением приэлектродных значений рН;

г)  с воздействием вблизи электрода промежуточно образующихся окислителей и восстановителей высокой концентрации.

Поиски оптимального моделирования электрохимического окисления токсичных компонентов привели исследователей к решению проблемы методом непрямого электрохимического окисления, при котором кровь не вступает в непосредственный контакт с электрохимической системой. Электролизу подвергается раствор переносчика активного кислорода, который в последующем вводится в сосудистое русло больного.

Схема непрямого электроокисления может быть условно представлена в следующем виде:

1.  Электрохимическое окисление переносчика кислорода (А) на электроде:

А н2 ° - 2 е > АО

2.  Введение АО в организм.

3.  Освобождение переносчиком активного кислорода или прямое окисление токсина (RH):

АО -> А + Оакт

Оакт + RH —> ROH или

AO + RH   > ROH + A.

Основные требования к переносчику кислорода сводятся к тому, что он должен быть нетоксичным для организма и легко из него выводиться, легко отдавать активный кислород и по возможности быть способным преодолевать «белковую блокаду». Для того чтобы максимально моделировать функции монооксигеназ печени, он должен обладать окислительно-восстановительным потенциалом, близким к обратимому потенциалу кислорода.

В качестве наиболее удобного переносчика кислорода предложен изотонический раствор хлорида натрия (0,89 %), в котором при электролизе на платиновых, окисных платино-титановых и других подходящих анодах происходит накопление активного кислорода в виде натрия гипохлорита (NaOCI).

Идея использования так называемого непрямого электрохимического окисления возникла при изучении механизма действия прямого окисления на биологические жидкости, когда обнаружилось, что при электролизе биологических жидкостей как промежуточный продукт в значительном количестве образуется гипохлорит натрия, являющийся сильным окислителем.

Образующийся при электролизе растворов хлорида натрия гипохлорит натрия является неустойчивым соединением и в отсутствии окисляющихся веществ постепенно разлагается, выделяя активный кислород и хлорид натрия.

NaOCI —> NaCI + Оакт.

Таким образом, при электролизе раствора хлорида натрия в воде в условиях, соответствующих образованию гипохлорита натрия, получается раствор, в котором в виде гипохлорита имеются запасы «активного кислорода».

Поэтому непрямое электрохимическое окисление с использованием в качестве переносчика активного кислорода гипохлорита натрия имитирует функцию биокатализатора цитохрома Р-450. Самое главное преимущество непрямого электроокисления с использованием гипохлорита натрия как переносчика активного кислорода заключается в том, что он позволяет обойти эффект «белковой защиты» токсичных метаболитов.

Известно, что активные соединения хлора, брома, йода и в частности, гипохлорита натрия образуются в организме в макрофагах во время фагоцитоза при адгезии и обездвиживании микробных клеток. Это говорит о физио- логичности гипохлорита натрия.

Известны способы получения гипохлорита натрия с помощью электрохимического окисления с применением диафрагменных и бездиафрагменных электролизеров и химическим взаимодействием полученного электролизом хлора со щелочью. Однако выпускаемый промышленностью гипохлорит натрия непригоден для медицинского применения.

Поэтому было предложено получать раствор натрия гипохлорита с помощью специальной электрохимической установки типа ЭДО (электрохимический детоксикатор организма) путем электролиза изотонического раствора хлорида натрия.

Приготовление растворов натрия гипохлорита на аппарате ЭДО-4 (см. рис.) осуществляют по следующей схеме:

•заполнение ячейки аппарата ретроградно из флакона с изотоническим раствором натрия хлорида по принципу сообщающихся сосудов с помощью магистрали из одноразовой инфузионной системы (не вскрывая флакон), а только проколов пробку иглой магистрали «воздушкой»;

•  включение установки в режиме 5 А - 30 минут (операцию повторяют дважды !!! для самостерилизации ячейки), полученный раствор используют только для дезинфекции и стерилизации;

•  включение установки в режиме 3 или 5 А (в зависимости от требуемой концентрации) - 6 минут; по окончании электролиза, выключают установку и сливают полученный раствор в стерильную, плотно закрываемую ёмкость (удобно использовать с этой целью пустой флакон, из которого система заправлялась.

Перспективность метода непрямого электроокисления с использованием гипохлорита натрия как переносчика активного кислорода, показанная в опытах in vitro, привела к необходимости изучения возможности его широкого применения в клинической практике.