Технология искусственного воспроизводства стерляди

Монтаж оборудования и его подготовка к работе

Биотехнический процесс воспроизводства стерляди начинается с обустройства цеха необходимыми аппаратами. В цеху были смонтированы рыбоводные модули: аппараты Вейса для обесклеивания икры, воздуходувка (компрессор), аппараты «Осётр», бассейны для выращивания личинок и молоди ИЦА-2. Оборудование размещено в цеху для удобной логистики, подключено к источникам воды и сливам, проверено на работоспособность и отказоустойчивость. Затем обработано дезинфицирующими растворами. Наиболее популярны органические красители. На рисунке 6 схематично показано размещение производителей стерляди в бассейнах ИЦА-2 внутри инкубационного цеха.

Схема инкубационного цеха для стерляди

Рисунок 9 – Схема инкубационного цеха.

1 – ИЦА-2 с самцами, 2 – ИЦА-2 с самками, 3 – вспомогательные бассейны передержки, 4 – аппарат «осётр», 5 – операционный стол, 6 - лабораторный стол, 7 – аппараты Вейса, 8 – уголок дежурного рыбовода, 9 – мальковые бассейны.

Аппарат «Осётр» мы запустили в «холостом» режиме для калибровки поплавков; количество качков должно быть от 5 до 8 в минутe. В таком режиме «Осётр» работал сутки.

Все аппараты были обработаны крепкими растворами органических красителей. Затем оставили оборудование на сутки заполненными растворами.

Результаты оплодотворения икры стерляди

В Южном Филиале селекционно-генетического центра рыбоводства (ЮФ ФСГЦР) сформировано крупнейшее в России гетерогенное маточное стадо стерляди (только в 2007 г. – в продуктивной части стада содержалось около 4,5 тыс. зрелых самок).

Ремонтно-маточные стада стерляди имеются практически на всех осетроводных хозяйствах и осетровых рыбоводных заводах Краснодарского края. Основой формирования этих стад стала оплодотворенная икра и личинки, полученные от ЮФ ФСГЦР. В свою очередь исходным материалом для формирования ремонтно-маточного стада стерляди в ЮФ ФСГЦР послужили живая икра и предличинки (в возрасте 1-3 сут.), завезенные из различных регионов России в период с 1993 г по 2001 год (таблица 1).

Для определения количества производителей, необходимых для нерестовой компании мы использовали формулу эффективной численности. Исходя из неё, можно считать, что группа из 150-250 особей (в зависимости от рабочей плодовитости) может быть необходимым и достаточным носителем генофонда конкретной популяции в неволе, особенно учитывая высокую индивидуальную плодовитость рыб, которая обеспечит потенциально более широкий генофонд по сравнению (Ананьев и др.,1999), например, с группой такой же численности млекопитающих или птиц.

Таблица 1 - Источники формирования живой генетической коллекции стерляди ЮФ ФСГЦР.

Место завоза Источник формирования маточного стада
ПТРХ Тольяттинской ТЭЦ Средняя Волга Куйбышевское вдхр.
ПТРХ Тольяттинской ТЭЦ Нижняя Кама
ПРВХ "Ставропольский" Нижняя Волга, г. Волгоград
ОАО "Волгореченскрыбхоз" Нижняя Волга, г. Волгоград

Верхняя Волга, г. Кострома

РВХ Пермской ГРЭС завезена из ОАО "Волгореченскрыбхоз"
Абалакский ОРЗ р. Иртыш, г. Тобольск
АО "Кармановский рыбхоз" бассейн р. Кама, р. Белая

К настоящему времени ремонтно-маточное стадо стерляди ЮФ ФСГЦР стерляди представлено 5-ю популяционными группами с более чем десятью возрастными группами в каждой.

Стерлядь инъецировали по схеме дробных инъекций, при которых доза препарата делится на равные части, вводимые рыбе через определенные промежутки времени. При такой схеме последняя инъекция называется разрешающей, а все остальные предварительными.

Таблица 2 - Количество единиц ремонтно-маточного стада, прошедшие весеннюю бонитировку и участвовавшие в нерестовой компании 2011 г.

Вид Категория Возраст, лет Количество
Самки Самцы
Стерлядь производители 5-7 и более 260 166
Ответившие на инъекцию: 246 158

 

Иногда в схеме дробных инъекций предусмотрено введение дополнительной дозы препарата после разрешающей инъекции. Эта доза называется завершающей и применяется когда необходимо увеличить концентрацию препарата в крови после начала действия разрешающей инъекции. Такую инъекцию вводили несозревшим вовремя самкам.

Из (таблицы 2) видно, что не все производители ответили на гонадотропные инъекции. Среди производителей, отобранных при весенней бонитировке по брачному наряду и УЗИ-сканированием как правило встречается особи, которых приходится либо исключать из нерестовой компании либо дополнительно выдерживать длительное время при определённых температурах, но икру они дадут неудовлетворительного качества для воспроизведения. Годится такая икра только для пищевого употребления.

При применении метода дробных инъекций сначала вводили очень небольшие дозы гипофиза, ускоряющие поляризацию ооцитов и переход гонад в IV-ой завершённую стадию зрелости, а спустя 24 ч вводили большую дозу гормона, которая завершает созревание и вызывает овуляцию ооцитов.

При двукратной схеме инъецирования наибольшее затруднение вызвал подбор начальной дозы гипофиза, стимулирующей завершение первых фаз развития ооцитов и переход их в фазы созревания: концентрацию ядрышек в ядре, движение ядра в сторону микропиле. Если к моменту введения первой дозы хромосомы и ядрышки уже сконцентрированы в центре ядра, такие ооциты завершают фазы развития, то есть проходят мейотические фазы деления и даже достигают предовуляционного состояния или метафазы второго деления созревания. При этом завышенные дозы при первой инъекции вызывают нарушения в прохождении указанных преобразований ядра в ооцитах, что задерживает созревание икры после второй дозы, либо вовсе делает невозможной её овуляцию.

Правильный выбор дозировки при первой инъекции имеет даже большее значение, чем при второй. Применение дозировок гипофиза без учёта коэффициента поляризации не всегда приводит к положительным результатам, величина оплодотворяемости икры колеблется в больших пределах, наблюдается асинхронность в созревании самок после разрешающей инъекции. В процессе работы эмпирически была выявлена закономерность в подборе первой дозы гипофиза в зависимости от коэффициента поляризации ядра. Установлено, что пресноводные осетровые хуже реагируют на синтетические гормональные препараты (нерестин, сурфагон, Ovopel, GnRH) и гораздо лучше откликаются на инъекции раствора гипофиза осетровых рыб. Поэтому стерлядь в подавляющем большинстве случаев была инъецирована чистым гипофизом осетровых дробным способом.

При устойчивой температуре (10—11 °С) производителей инъецировали из расчета: 1—2 мг гипофиза — предварительная и 10—12 мг гипофиза на 1 кг рыбы — разрешающая инъекция. Через 1 день самки созрели, что было установлено визуально по отдельно рассеянным по дну лотка икринкам или путем осторожного отцеживания малых порций икры (самок просматривали через каждые 1,5—2 ч). Не созревших самок оставляли в бассейнах до следующего утра.

В отличие от гипофизарных препаратов, релизинг-гормоны не повреждают ооциты даже при 400-кратном превышении доз (Гончаров, 1998). Препараты могут вводиться единовременно, дробно или градуально. Наиболее эффективен «Сурфагон» при работе с самками проходных видов – севрюги, русского осетра и белуги, и самцами всех видов, для которых оптимальной дозой является 1 мкг/кг. Для стерляди и ленского сибирского осетра препарат менее эффективен, однако в случае отсутствия гипофизарных препаратов при оптимальной нерестовой температуре его можно применять, однако дозировки в этом случае следует увеличить.

При инъецированные производителей стерляди кроме чистого гипофиза были также использованы растворы сурфагона в качестве эксперимента. Дозировка подбиралась аналогично гипофизной для данного вида рыбы. Из 14 самок не одна не ответила на инъекцию.

Общие рекомендации по инъецированию. Для инъекций использовали обычные одноразовые медицинские шприцы. Длину иглы и объем шприца подбирали в зависимости от размера рыбы и дозы препарата. Диаметр иглы зависит от того, какой препарат вводится. При использовании ацетонированных гипофизов необходимо использовать иглы для внутривенных инъекций (большего диаметра). Хорошие производители при правильно подобранных дозах инъекций созревали синхронно. Несозревших в течение рабочего дня самок оставляли в цеху

При приготовлении раствора ГГП и суспензии ацетонированного гипофиза необходимо, чтобы объем готового препарата для рыб массой до 5 кг не превышал 2 мл. Инъекцию производили в спинную мышцу между спинными и боковыми жучками на уровне 2-4 спинной жучки. Следует соблюдать осторожность при введении препаратов в мышечные ткани, следить, чтобы рыба при сжатии мышц не вытолкнула препарат. При инъекции препарат не должен вводиться подкожно, нельзя допускать попадания иглы и препарата в жировые ткани. Опасно также слишком глубокое введение иглы (можно повредить спинной мозг или крупные сосуды). Если одной рыбе производили 2 инъекции, вторую инъекцию делали в другую сторону спины, чтобы избежать потерь препарата через отверстие, оставшееся после первой инъекции. После инъекций шприцы и иглы мыли чистой теплой водой и хранили сухими. Специальной дезинфекции не требовалось. Для приготовления суспензии ацетонированных гипофизов применяли медицинский физиологический раствор (Детлаф и др, 1984). Этот же раствор использовали и для разбавления сурфагона, в случае если необходимо снизить его концентрацию. Не следует хранить разбавленные препараты и приготовленную суспензию, все препараты приготовлялись и набирались в шприцы непосредственно перед инъекциями.

Есть ещё один способ инъецирования осетровых. Достаточно спустить воду в бассейне до такого уровня, чтобы была видна спина рыбы. При должной сноровке и опыте можно поймать момент, когда рыба движется в толще воды и сделать укол в спину, при этом надо, без промедления, выдавить поршень и оставить шприц в спине рыбы. Это препятствует вытеканию препарата из раны и служит своеобразной меткой для уже инъецированных рыб: одной рыбе не сделают два укола. Также нет необходимости подвергать животное стрессу, доставая его из воды. Чем больше рыба, тем спокойней она относится к уколу (это объясняется закономерностью: чем больше животное, тем выше его болевой порог), иногда даже не меняя поведения при инъекции. Через несколько минут следует изъять из рыб шприцы для дезинфекции  и повысить уровень воды до прежней отметки.

Доза для самцов была в два раза меньше, чем для самок, а инъекции производились одновременно с предварительной инъекцией самкам. В начале и в конце сезона, при пограничных нерестовых температурах самцов инъецируют также градуально, снизив относительные дозировки на 25-50% относительно самок.

На последнем этапе созревания вместе с овариальной жидкостью вытекает икра (количество икринок может быть как очень малым, так и значительным). Вытекание большой порции икры при просмотре самки в этот период часто служит причиной преждевременного забоя заводским методом или неудачных попыток отбора икры прижизненными методами;

Практически полная овуляция икры сопровождается самопроизвольным ее выбоем, обнаружить который проще, установив на сливные гусаки бассейнов сито из полимерной или металлической сетки с размером ячеи около 1 мм. При надавливании на заднюю часть брюшка или сгибании рыбы наблюдается струя икры. Вместе с тем давление на брюшко или сгибание рыбы может не вызвать выход икры из полового отверстия.

Причиной задержки выхода икры могут являться или «пробка» из склеившихся при попадания в заднюю часть яйцевода воды икринок, или сжатые мышцы (при небольших размерах полового отверстия). Поэтому рекомендуется введение пальца в половое отверстие как для удаления "пробки", так и для снятия мышечных спазмов. Отсутствие сильной струи икры из полового отверстия является частой причиной задержек при взятии икры, что негативно сказывается на ее рыбоводном качестве. Вместе с тем, струя икры при просмотре самки не всегда означает, что большая часть икры овулировала.

При просмотре самок необходимо снизить до минимума стрессирующие рыбу воздействия. Рыб не просматривали раньше наступления расчетного времени. Установка сит на сливные гусаки бассейнов значительно облегчает контроль над созреванием самок. При просмотре самок не следует привлекать лишних людей, не должно быть шума. Свет в помещении горел постоянно.

После размещения производителей в бассейнах стерлядь не кормили и не беспокоили 3 суток. За это время рыба адаптируется к температуре и воде. Бассейны накрывали сеткой, иначе есть риск выпрыгивания рыбы. Не в коем случае не оставляли оставлять цех без присмотра, дежурный постоянно следил за производителями и водоподачей, а позже и за инкубационным аппаратом. На рисунке представлен график температур в период с 1 по 15 мая на момент созревания, инкубации и выклева личинок.


Температурный режим воды в бассейнах для стерляди

Рисунок 12 – Температурный режим воды в бассейнах.

Процедуру сцеживания икры у каждой самки производили дважды. Перед первым сцеживанием у созревших рыб подрезали яйцевод. При втором сцеживании (через 1–2 часа после первого) изымалась остаточная икра, рыбоводные и технологические качества которой, как правило, хуже, чем в первой порции. Отход самок после получения икры не превышает 1% в год.

Интенсивная эксплуатация самок может приводить к появлению в сцеженной овулировавшей икре включений, которые обычно в ней не встречаются: прошлогодней икры и прозрачных пузыревидных тел с жидким содержимым и хрящевыми включениями. Прошлогодняя икра имеет вид небольших пластинок, образованных сплющенными посветлевшими овулировавшими икринками, которые не были сцежены в предыдущий нерестовый сезон и сохранились в полости тела рыбы, застряв между внутренними органами. Обычно таких икринок немного, и на рыбоводном и технологическом качестве икры новой генерации их присутствие отрицательно не сказывается. Обычно описываемые образования встречаются единично, но у самок через год после принудительного выдавливания неовулировавшей икры они могут появляться в массовом количестве.

Получение овулировавшей икры. При использовании метода Подушки ("надрезания яйцеводов") (Подушка, 1986) самку помещали на специальный наклонный столик, конструкция которого может быть различна, в положении на боку, головой вверх. Через половое отверстие вводили скальпель и делали надрез длиной 1,5-2,5 см в каудальной части стенки одного или обоих яйцеводов, открывая тем самым брюшную полость в ее каудальной части. Через полученный разрез икру сцеживали, аккуратно массируя заднюю треть брюшка. Иногда для поддержания созданного разреза в открытом состоянии приходится прибегать к помощи ручки скальпеля или другого плоского металлического предмета.

После получения икры разрезы не требуется зашивать, а икру через них можно сцеживать в несколько приемов. Этим методом можно получать икру от больших партий самок, так в ЮФ ФСГЦР методом надрезания яйцеводов за один день одним оператором была получена икра от 200 самок стерляди. При сцеживании получение икры происходило без оперативного вмешательства. При данном методе с определенными интервалами сцеживали икру из яйцеводов или чередовали сцеживание с массированием брюшка от хвоста к голове, в результате которого яйцеводы наполнялись очередной порцией икры. Даже при наличии достаточных навыков этим методом сцедить практически всю икру невозможно.

В некоторых случаях абдоминальные поры у самок могут быть настолько велики, что без надреза и дополнительных усилий через них может быть сцежена в 1-2 приема вся овулировавшая икра, как при использовании метода Подушки. К недостаткам данного метода относятся длительность, трудоемкость, ухудшение качества икры в последних порциях и неполное сцеживание. Эта технология не пригодна для получения икры от крупных промышленных партий самок.

Иногда, для упрощения операции отбора икры или избегания массирования брюшка рыбы, которое может негативным образом сказаться на состоянии, как кожных покровов, так и внутренних органов, используют различные приспособления, действующие по принципу вакуумного насоса. Наиболее удобным является хирургический аппарат для отсоса крови (Мальцев, 2002). Однако при использовании подобного оборудования следует производить точную регулировку давления, чтобы избежать повреждения ооцитов. Следует еще раз отметить, что качество полученной икры в первую очередь зависит от точности времени ее отбора.

В период получения и отбора наиболее перспективной икры стерляди в производственном процессе было задействовано 260 самок донской стерляди. Для дальнейшего биотехнологического процесса по воспроизведению годилась не вся икра. Отбор осуществлялся визуально по размеру (отдавалось предпочтение наиболее крупной икре), пигментации, весу (учитывалось количество икринок в грамме). Из 260 самок 14 не ответили на инъекцию сурфагона, из 246 ответивших было получено для техпроцесса 15,0 кг икры. Остальная полученная икра была использована в пищевых целях.

Получение спермы. Для отбора спермы потребовалась ветошь, стандартный набор мужских уретральных катетеров разных размеров из ПХВ или красной резины и пластиковые одноразовые шприцы Жане, количество которых подбиралось по количеству самцов, обычно единовременно используемых при воспроизводстве. Подбирался катетер, плотно входящий в половое отверстие, не повреждая его. Катетер надевался на шприц Жане. Катетер и шприц должны быть сухими и чистыми. Самца фиксировали на боку, брюхом к самому краю столика, накрытого сухой ветошью, одновременно зажимая половое отверстие, чтобы избежать потерь спермы.

Половое отверстие и область вокруг него насухо вытиралась ветошью, конец катетера вводился в половое отверстие так, чтобы конец вошел в один из семяпроводов на 1-3 см, шприц опускался чуть ниже края стола, так чтобы наклонно расположенный катетер от полового отверстия к шприцу не имел петель и изгибов. Очень медленно отводили поршень шприца, набирая сперму, наблюдая, чтобы катетер не присасывался к стенкам семяпровода, т.к. это может их повредить и привести к попаданию крови в сперму. Важно не допускать хранения спермы от нескольких самцов в одной емкости. В случае попадания в емкость различной спермы оплодотворяющая способность такой смеси резко падает и может быть полностью утрачена за 20-30 мин. Смешивание спермы было осуществлено только непосредственно перед оплодотворением.

Следует отметить, что оплодотворение одной самки несколькими самцами в «одном тазу» не обеспечивает должного уровня генетической разнокачественности получаемого потомства, формирование которой особенно важно в условиях ограниченного числа производителей и низкой эффективной численности искусственно формируемой популяции. Причина этого разнокачественность спермы, получаемой от разных самцов. Сперма различных самцов имеет разную активность и концентрацию, в значительной мере зависящие от физиологического состояния самцов, условий преднерестового выдерживания и получения спермы, кратности и времени отбора эякулята. В случае оплодотворения икры от одной самки спермой разного качества велика вероятность преобладания в потомстве особей от одного самца, что неприемлемо при формировании гетерогенного стада или популяции.

Работы, проведенные в Южном филиале ФСГЦР, показали, что для получения генетического разнокачественного потомства осетровых рыб, икру, полученную от одной самки, целесообразно разделять на 3-5 порций, оплодотворяя каждую порцию спермой одного самца, а после оплодотворения ее можно снова соединять, обесклеивая и инкубируя вместе.

После получения спермы оценивали ее качество. В настоящее время используется ряд критериев оценки качества спермы сельскохозяйственных животных, из которых, ввиду технологических особенностей, для осетровых рыб применяют только один – подвижность сперматозоидов по бальной системе (Персов, 1975), оценивающей долю неподвижных и совершающих колебательные движения сперматозоидов, и долю сперматозоидов, совершающих поступательные движения, после добавления в сперму воды. Такой критерий, как концентрация спермы, оценивался «на глаз» и практически не учитывался. Применение показателей скорости движения сперматозоидов и продолжительности их активности не принимались во внимание.

Возможность полиспермного оплодотворения обусловлена наличием у икры осетровых рыб нескольких или многих микропиле. Именно эта особенность и определяла применение «полусухого» (или «русского») способа оплодотворения.

Основной принцип данного способа заключается в том, что в икру добавляли уже раствор спермы в воде, концентрация которого обеспечивает наибольшую вероятность моноспермного оплодотворения. Для достижения необходимой концентрации оптимальное соотношение спермы и воды составляло 1:200. Этот же прием позволял избежать продолжительного пребывания икры в воде без спермы (как при «мокром» способе), т.к. икра сразу попадала в раствор спермы в воде, где очень быстро оплодотворялась.

В процессе оплодотворения важно соотношение икры и оплодотворяющего раствора. Учитывая, что избыток оплодотворяющего раствора при оплодотворении «полусухим» способом не имеет негативных последствий необходимо было обеспечить соотношение икры и раствора, при котором всю смесь было бы легко перемешивать, и обеспечивался контакт всех икринок с оплодотворяющим раствором. Минимальное отношение спермы и икры составляло 10 мл/кг или 2 л оплодотворяющего раствора на 1 кг икры. Вместе с тем, при наличии густой, трудноотделимой овариальной жидкости, крови или частичной резорбции количество оплодотворяющей жидкости увеличивали в 1,5-2,0 раза.

Действующие рекомендации определяют время оплодотворения для разных видов осетровых рыб от 3 до 5 минут, обеспечивая максимальную реализацию оплодотворяющего потенциала спермы, вместе с тем практически вся полноценная икра способная к оплодотворению оплодотворяется в течение первых 20-60 секунд. При этом, у части рыб, особенно стерляди, икра приобретает клейкость еще до завершения процедуры оплодотворения, что затрудняет работу. Во многих странах с развитым осетроводством икру осетровых рыб не оплодотворяют дольше 1 минуты.

В процессе получения половых продуктов для осеменения икры участвовало 166 самцов. Из всей спермы, которая была получена, было отобрано 150 мл молок. Отбор осуществляли по шкале подвижности спермиев. Определение активности и времени сохранения подвижности (ВСП) спермиев осуществляли при разбавлении спермы водой, той же в которой были произведены оплодотворение и инкубация икры.

Обесклеивание икры.

Эффективным веществом является «голубая» или вулканическая глина, (Подушка, 1999). «Голубая» глина была испытана на многих рыбоводных хозяйствах и хорошо себя зарекомендовала.

«Голубая глина»(ТУ 5142-001-46893474-97)(Подушка,1999) хранилась в сухом виде, за сутки перед применением разводилась кипятком до консистенции жидкой сметаны. 300г сухой глины на 5л воды и затем обесклеивание в течении 35-45 мин.

Процент оплодотворения показывает, что более 1,5 на 1 ёмкость аппарата Вейса объёмом 30 литров загружать не рекомендуется. Если превысить цифру в 1,5 кг, процент оплотворения падает (таблица 4).

Другим возможным путем лишения икринок клейкости является химическая коагуляция гиалуроновой кислоты применением танина, который

кроме доступности и относительной дешевизны очень эффективен при невысоких концентрациях и малой экспозиции. При этом применение данного препарата требует осторожности и точности дозировки и времени обработки, т.к. может вызвать гибель икры. Также крайне важно при использовании танина избегать препарата с истёкшим сроком годности.

Таблица 4. Итоговые данные получения, оплодотворения и обесклеивания икры.

Количество самок 260
Количество самцов 166
Оплодотворённая икра, кг 15,0
Количество молок, мл 150
Количество икринок, шт 1800000
Количество аппаратов для обесклеивания, шт 9
Аппарат, № Вес загруженной икры, кг/шт Процент оплодотворения,%
1 1,5/180000 51
2 1,8/216000 34
3 1,8/216000 35
4 1,5/180000 55
5 1,9/228000 16
6 1,7/204000 46
7 1,7/204000 38
8 1,5/180000 52
9 1,6,192000 41

Из 1 800 000 шт икринок оплодотворилось и обесклеилось 720 000 шт, что составляет 40%.

Результаты инкубации икры стерляди

Обесклеенную икру размещали в инкубационные аппараты «Осётр». В аппарате «Осетр» инкубируемая икра закладывалась в изолированные ящики, из которых свободные эмбрионы по общему желобу попадали в личинкоприёмник и по мере его наполнения переносятся в бассейны. Норма загрузки стерляди в инкубационный аппарат «осётр» на один ящик – 200-250 тыс. шт.

В ходе инкубации для оценки рыбоводного качества икры, определялся процент оплодотворения и доля типично развивающихся эмбрионов.

Для определения процента оплодотворения икру в аппарате перемешивали, брали пробу 200-300 икринок и подсчитывали долю нормально развивающихся эмбрионов в общем количестве икринок в пробе. Также по возможности повышали коэффициент оплодотворения, отбирая погибшую икру из рыбоводного аппарата. Время отбора проб определялось по графикам (Детлаф и др., 1981). Дальнейшее наблюдение за эмбриональным развитием включало определение процента нормально развивающихся эмбрионов. Во время инкубации икры, особенно на стадиях дробления и гаструляции избегали механических воздействий, в том числе тряски при переноске и отборе икры.

Интенсивность потребления кислорода в процессе эмбрионального развития увеличивалось. Содержание растворенного в воде кислорода не снижалось менее 7,5 мг/л. Концентрация ниже 6 мг/л (80% насыщения) приводит к различным отклонениям в развитии (гипертрофия сердца, водянка перикарда и др.), концентрация кислорода 3 -3,5 мг/л приводит к полной гибели эмбрионов. Одним из показателей нормального эмбрионального развития, характеризующих качество полученного потомства, являлась синхронность развития зародышей. В ходе нормального развития икры стадийный разброс развития не должен превышать более двух стадий в пробе (Детлаф и др.,1981).

Изменение темпов и синхронности эндогенного развития рыб может возникать вследствие повреждающего воздействия абиотических факторов. С повышением температуры наблюдалась десинхронизация развития, которая характеризуется большими стадийными различиями, приводящими к формированию различных уродств, значительному увеличению продолжительности выклева, проходящего без ярко выраженного пика (Вернидуб, 1951; Детлаф и др., 1981).

Подобные явления довольно часто наблюдаются при инкубации икры на рыбоводных заводах, где создание оптимальных условий обычно сопряжено со многими техническими трудностями. Управление температурным режимом инкубации икры позволяет избежать негативного воздействия изменений температуры за пределами оптимального интервала и создать наиболее благоприятные условия для развития эмбрионов, предотвращая этим также поражение их сапролегнией.

Оптимальная температура для развития икры стерляди 13-15 °С. Значительное отклонение от оптимальных температур как: в сторону повышения, так и понижения приводит к различным уродствам и гибели эмбрионов. Контроль над температурным режимом осуществлялся каждые 2 часа. Суточные колебания температуры воды не должны превышали 3 °С. Температурные показатели, ход и результаты инкубации регистрировали в журналах.

Особое внимание на этом этапе следует уделить появлению на мёртвой икре гифов разновидности плесневого грибка сапролегнии (Saprolegnia). Сущёствует несколько родов - грибы Achilla, Aphanomyces, Saprolegnia, вызывающих похожие симптомы заболевания у икры и молоди осетровых. Наиболее часто встречается именно грибы рода Saprolegnia. В зависимости от условий окраска грибка может быть белой и слабо-жёлтой. Имеют разветвляющиеся и неразветвляющиеся нитеобразные гифы, лишённые перегородок, толщина которых достигает 75 мкм. Гифы окружены оболочкой и заполнены протоплазмой, которая содержит большое количество ядер. Терминальная часть гифа расширена и образует оболочки с зооспорами. При созревании спор оболочка разрывается, и зооспоры выбрасываются во внешнюю среду. Эти грибы могут размножаться и половым путём. Гифы сначала образуются на мёртвой икре и если её вовремя из аппарата не извлекали, сапролегния переходила на здоровые икринки. Лечение: вовремя и периодически отбирали из аппаратных лотков мёртвые икринки и оболочки, а также погибших предличинок. Воду до начала выклева обрабатывали органическим красителем метиленовым синим. Концентрацию дозировали по литературным рекомендациям к применению метиленового синего. Над аппаратами ставили капельницы, чтобы поступление раствора было постоянным. Также хорошо зарекомендовал себя ветпрепарат для борьбы с грибковыми заболеваниями, применяющиеся для аквариумных рыб, Сера Микопур (Sera Mycopur). Также воду перед попаданием в аппараты можно стерилизовать ультрафиолетовым бактерицидным излучением с длинной волны 254 нанометра. Слой воды 1 см должен непрерывно обрабатываться 9 секунд с мощностью лампы из расчёта 18-24 ватта на кубометр.

Для борьбы с сапролегнией были использованы органический краситель метиленовый синий и ветеринарный препарат Сера Микопур.

0,3 г метиленового синего разводилось в 50 мл воды. Это количество рассчитано для объема воды 100л, то есть по 5 мл данного раствора на каждые 10 л воды. В такой концентрации раствор устанавливался в капельнице над лотком с икрой. Экспозиция не более 2 часов.

Микопур дозировался исходя из инструкции к препарату.

Таблица 5 – Применение препаратов для борьбы с сапролегнией.

Контроль Метиленовый синий Микопур
Экспозиция - 2 часа 2 часа
Выход, % 32 48 65

 

Расход мл/ч - 150 10

 

Из таблицы 5 следует, что целесообразно ставить капельницы с растворами в условиях систем оборотного водоснабжения. Ультрафиолет малоэффективен в таких условиях. Из плюсов метиленового синего – его доступность, цена, длительность хранения. Недостатки – канцерогенный эффект, подбор точной дозировки, при преждевременном выклеве может пострадать предличинка. Что касается микопура, то плюсы – малое количество препарата при дозировках (необходимо в 15 раз меньше, чем метиленового синего), не канцерогенен, не вредит предличинкам, гибкость в экспозициях – можно применять как единовременно, так и капельно. Из минусов – цена препарата выше метиленового, доступно только в ветаптеках и зоомагазинах.

Таблица 6 – Результат оплодотворения и инкубации икры стерляди.

Аппарат, №, количество загруженной икры, шт Процент оплодотворения,%/ шт Выход предличинок в %/шт
1 180000 51/92000 85/79000
2 216000 34/73000 80/58000
3 216000 35/75000 81/61000
4 180000 55/99000 86/86000
5 228000 16/36000 77/28000
6 204000 46/94000 87/82000
7 204000 38/78000 85/66000
8 180000 52/94000 86/81000
9 192000 41/79000 75/59000
Итого:
1800000 40/720000 83/600000

Из 720 000 заложенных икринок выклюнулось 600000, что составляет 83%.

Выращивание молоди в бассейнах

Начало выклева характеризовалось появлением в инкубационном аппарате единичных плавающих предличинок. Постепенно их число увеличивалось и время, когда в аппарате появляется несколько сот предличинок, было началом массового выклева.

Выклюнувшихся предличинок переносили в пластиковые бассейны (ИЦА-2 или др.). Оптимальный слой воды – 20 см. Подсчёт предличинок вёлся визуально по эталону 500 шт. На следующий день после посадки предличинок в бассейнах производился отбор оболочек, мёртвой икры и уродливых особей. Отбирали погибшую икру и оболочки при помощи резинового сифона. В последующие дни количество погибших личинок подсчитывалось ежедневно и заносилось в рыбоводный журнал.

Следует отметить важность оценки размеров желточного мешка при осуществлении рыбоводно-экологического мониторинга молоди, выращенной на осетровых заводах. Показателем деформации желточного мешка предличинок осетровых, являлось отношение его высоты к длине, составляющее в норме 0,55-0,69. Для деформированного (грушевидного или удлиненно-овального) желточного мешка данное отношение уменьшалось до 0,29-0,44. (Е. С. Беляева, 1983). В случае небольших размеров мешка (и значительной индивидуальной изменчивости его морфометрических показателей) эндогенные ресурсы не обеспечивают дальнейший рост и нормальное развитие на одном из наиболее важных этапов – переходе к экзогенному питанию. Вместе с тем, и излишне большой объем желтка на стадиях дифференцировки отделов пищеварительной системы негативно влияет на их формирование, приводя к задержке секреторной функции эпителия (Гербильский, 1957; Богданова, 1972).

Скорость утилизации желточной массы также связана с развитием молоди. Ускорение рассасывания желточного мешка (по сравнению с предшествующим этапом – пассивным залеганием на дне бассейнов) обусловлено началом активного плавания предличинок и ускорением процессов морфогенеза

Таблица 7 - Нормативы содержания молоди.

Показатели Норматив
Площадь рыбоводных бассейнов, лотков, м2 4-6
Плотность посадки, тыс. шт./м2 6-8
Глубина воды в бассейне, см 20
Содержание кислорода мг/л 7-9
Освещённость, люкс 40-80
Расход воды, л/мин. 8-14

При выдерживании предличинок в бассейнах, так же, как и в период инкубации икры, осуществляли постоянный контроль за температурным и кислородным режимом.

Следует отметить некоторые особенности поведения предличинок в первые дни жизни. После выклева предличинки рассеивались в толще воды и совершали так называемые «свечки»: периодически поднимались к поверхности воды и опускались на дно бассейна. При естественном нересте такое поведение предличинок осетровых позволяет им, во-первых, избежать заиливания, и, во-вторых, скатываясь по течению быстрее достигать зон богатых кормовыми организмами.

Таблица 8 -Плотность посадки молоди при бассейновом выращивании.

Масса рыбы, г Температура воды, оС тыс. шт./м2 тыс. шт./м3
0,04-0,07 16-17 5-7 25-35
0,07-0,5 17-19 3-5 15-25
0,6-1,0 19-20 2,0 10
1,1-3,0 20-22 1,0 2,5
3,1-5,0 22-24 0,5-0,8 0,7-1,0
5,1-30,0 24-26 0,2-0,25 0,25-0,30
более 30,0 24-26 0,1-0,15 0,1-0,15

При переходе на жаберное дыхание и стадии формирования пищеварительной системы, так называемый период «роения», предличинки опускались на дно бассейна и образовали различного рода скопления («пятна»). В случае, если скопления личинок находятся в зонах с низким водоснабжением, возможна их гибель из-за недостатка кислорода (интенсивность потребления кислорода к этому периоду возрастает в несколько раз по сравнению с эмбриональным).

На этом этапе также возможна массовая гибель предличинок, которая может быть вызвана как рыбоводным качеством икры, так и неблагоприятными условиями выращивания.

По достижению этих стадий, предличинки, имеющие морфофизиологические дефекты и отклонения в развитии органов дыхания, пищеварения, ферментной системы уже не были способны к дальнейшему развитию и погибали. В связи с этим было необходимо каждые трое суток отбирать пробы в количестве 30-50 штук живых и погибших предличинок для наблюдения за развитием и оценкой качества предличинок.

Появление на дне бассейна единичных меланиновых пробок служило сигналом к началу первого кормления, которое осуществляют при выбросе меланиновой пробки у 2-3% личинок. Период выброса меланиновых пробок может длиться 3-4 суток, а несвоевременное внесение корма приводит к взаимному травмированию и гибели личинок. В частности стерлядь обкусывает плавники друг другу, у белуги же, например, в этом период наблюдаются случаи каннибализма.

Сроки перехода на активное питание зависят от температуры воды и ее химического состава. До возраста 10 суток оптимальные температуры выдерживания предличинок соответствуют оптимуму нереста: 13-17 ºС.

В период перехода на активное питание следует избегать резких колебаний температуры воды. Так, понижение температуры, несмотря на выброс меланиновых пробок, может вызвать у личинок отказ от корма, что объясняется замедлением процесса резорбции жира в пищеварительной системе (хорошо заметно при осмотре брюшной стороны личинок).

В качестве живого корма традиционно используют науплий артемии, дафнию, моину, или мелкорубленых олигохет. Суточная норма потребления живых кормов рассчитывалась в соответствии с планируемым приростом и кормовым коэффициентом потребляемых организмов (науплии артемии 2-4, дафнии – 6, олигохеты – 2). Для кормления подрощенной молоди можно использовать трубочник, при этом крупные личинки могут потреблять целых червей. Суточные дозы кормления варьируют от 20 до 30% от массы тела личинок.

Применение дафнии неоднозначно. С одной стороны это эффективный, доступный, лёгкий в культивации живой корм. Однако, как правило, культивируются дафнии в открытых водоёмах. Только так можно обеспечить достаточное количество дафнии для кормления молоди. Скармливая дафний из таких водоёмов молоди в бассейнах, существует риск занести инфекционное заболевание.

Кратность кормления по суточному рациону живыми кормами зависит от видовой специфики интенсивности переваривания кормовых объектов. Суточная норма дафнии составляла 40-50%. Дафнии или науплии артемий лучше всего разводить водой в определенном объеме, рассчитанном соответственно по количеству молоди в бассейне. Обычно при полноценном питании (качество и количество) личинки стерляди за 5-6 суток достигают массы 80-90 мг. В процессе подращивания контролировали плотности посадки и размерную структуру осетровых рыб в каждом бассейне, проводя вовремя сортировки.

Кормление искусственными кормами. Длительное использование только живых кормов может существенно осложнить последующий переход молоди на искусственные корма (облегчить такой переход может одновременное использование нескольких видов живых кормов). Поэтому применяли пылеобразные фракции искусственных кормов сразу при переходе на активное питание с постепенным повышением их доли в общем рационе.

Суточные нормы кормления комбинированными кормами рассчитывали на период 5-10 дней (в зависимости от возраста рыбы) с учетом температуры воды, средней массы молоди и ее количества. Определение средней массы производили один раз в трое суток, начиная с момента перехода на активное питание. Численность рыбы определялась с учетом погибшей. Кроме этого, в зависимости от массы молоди подбирали фракцию (размер крупки) стартовых кормов. Для кормления молоди осетровых рыб можно использовать корма отечественного и импортного производства с содержанием белка не менее 48-55% и жира 8-12%. Наиболее эффективны сбалансированные полноценные корма отечественные корма производства НТЦ «Аквакорм» - ОСТ-4, ОСТ-6, а также фирм производителей «Крафт» (Германия), «Биомар» (Дания), Аллер Аква (Польшп). Рецептуру, рекомендации, кормовые коэффициенты и периодичность кормления производитель указывает в сопровождающих корм документах.

В процессе подращивания контролировали плотности посадки и размерную структуру осетровых рыб в каждом бассейне. При достижении массы 0,2-0,3 г, каждые 7 дней проводили сортировку молоди, выделяя три размерные группы: крупную, среднюю и мелкую. Необходимость сортировки объясняется пищевой конкуренцией при интенсивном росте молоди и невозможностью точного определения количества задаваемого корма в случае, если масса молоди в одном бассейне различаются более чем на 50%.

В период кормления искусственными кормами молоди осетровых обеспечивали чистоту бассейнов и не допускали накопления остатков корма. Чистили бассейны после каждого кормления. Личинка и молодь имела не более 15 минут доступа к корму, После того, как истекали 15 минут, резко повышался сброс воды из бассейна, унося с собой остатки несъеденного корма и экскременты рыб.

Следует отметить важность своевременной замены фильтрующих решеток на стоке воды из бассейнов. По мере роста личинок, ячейка сливного экрана на «фонарях», «стаканах» должна увеличиваться от 1мм при выдерживании предличинок, до 2мм при переходе на активное питание и далее постепенно до 7мм при выращивании молоди до 10г.

Во время кормления личинок были использованы как живые корма (дафния, науплии артемий) так и искусственные (Аллер Аква). В начале кормления первую неделю в один бассейн вносились 50% живых кормов и 50% искусственных (опытная группа), в остальные же 80% Аллер Аква и 20% живых кормов (контрольная группа). В результате темп роста у молоди, питавшейся 50% живыми кормами, был заметно выше (рисунок) – на 35 день опытная группа имела навеску м, тогда как контроль был весом в среднем 680 мг. Однако последующий отход из-за отказа опытной группы от питания полностью искусственным кормом нивелировал это достижение. Отход опытной группы составил более 80%. Опыт на этом был прекращён.

Из выклюнувшихся 600 000 шт предличинок, на активное питание перешли 480 000 шт (80%), а навески более 3 г достигло всего 410 000 шт (68%).

Таблица 9 -Нормы кормления и рационы.

Дни 7 14 21 28 35
Опыт и контроль О К О К О К О К О К
Средняя масса, мг 2 2 75 70 180 160 340 310 750 680
Яйца науплий, % 50 20 50 20 70 10 80 0 0 0
Аллер аква, % 50 80 50 80 30 90 20 100 100 100
Суточная доза от массы, % 20 15 10 10 8

Таблица 10 - Количество молоди стерляди по мере развития.

Закладка икры, шт/% 1 800 000/100
Оплодотворение, шт/% 720 000/40
Выклев, шт/% 600 000/83
Переход на активное питание шт/% 480 000/80
Молодь массой 3 г шт/% 410 000/85

Как видно из таблицы 10, из 1800000 полученных икринок только 410000 развились до массы 3 г, что составляет 23%. Это удовлетворительный результат.