Диагностические исследования лейкоза КРС

У крупного рогатого скота проводится прижизненная, предубойная и послеубойная диагностика на лейкоз. Диагноз устанавливают на основании эпизоотологических данных, клинических, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных исследований, которые включают серологические, гематологические и гистологические исследования.

Прижизненная диагностика лейкоза

Основу диагностики лейкоза крупного рогатого скота составляет серологический метод исследования – реакция иммунодиффузии в агаровом геле (РИД).

Из числа положительно реагирующих по РИД животных (инфицированных ВЛКРС) с помощью гематологического и клинического методов, выявляют больных лейкозом.

При первичной постановке диагноза в хозяйстве, на ферме, в стаде проводят диагностический убой больных животных с последующими патологоанатомическими и гистологическими исследованиями. Больными признаются РИД – положительные животные, у которых при однократных гематологических исследованиях установлены изменения, характерные для данной болезни.

Серологический метод диагностики лейкоза КРС

У животных зараженных ВЛКРС, вырабатываются антитела к вирусным антигенам. Характерная особенность инфекции ВЛКРС – это появление специфических антител в крови через 2 – 8 недель после заражения и пожизненное сохранение в организме инфицированных особей. Серологическими методами ВЛКРС можно выявлять у животных только старше 6 месяцев, т.к. у телят, выпаиваемых молоком и молозивом инфицированных ВЛКРС матерей, имеются пассивно приобретённые материнские антитела, которые персистируют (сохраняются) до шестимесячного возраста.

Метод реакции иммунодиффузии (РИД) основан на обнаружении в сыворотки крови животных специфических преципитирующих антител против вируса лейкоза крупного рогатого скота. Пробы крови для исследования отбирают не ранее, чем через 30 – суток после введения животным вакцин и аллергенов, у стельных коров – за 30 суток до и после отёла. Животные, сыворотки которых дали положительный результат в РИД, считаются заражёнными вирусом лейкоза, их необходимо исследовать гематологическим методом.

Гематологический метод

В периферической крови наблюдают количественные и качественные изменения клеток, особенно лейкоцитов, являющиеся одним из существенных признаков лейкоза. Метод заключается в количественной и качественной оценке лейкоцитов периферической крови животных, отнесенных по результатам РИД к группе инфицированных ВЛКРС.

При гематологическом исследовании осуществляют:

подсчет количества лейкоцитов при помощи электронных счётчиков или в камере Горяева;

дифференцированный подсчёт лейкоцитов в мазках (выведение лейкоформулы) или лимфоцитов при помощи фазово – контрастного микроскопирования крови в камере Горяева;

оценку количества лейкоцитов и абсолютного количества лимфоцитов по «лейкозному ключу»

Объектом гематологического исследования является периферическая кровь, пунктаты костного мозга, селезенка, лимфоузлы. Кровь для этих исследований берут из ярёмной вены в пробирки с антикоагулянтом. В качестве антикоагулянта используют трилон Б из расчёта 1 капля 10 % - ного раствора на 1 мл крови, гепарин, или 6 % раствор лимоннокислого натрия (1 капля на 1 мл крови). Стабилизированную кровь до исследования хранят в холодильнике при температуре 2 – 4 градуса С и исследуют не позднее, чем через 36 часов с момента взятия.

Дифференцированный подсчёт лейкоцитов (выведение лейкоцитарной формулы) проводят при обнаружении повышенного их количества. Для этой цели готовят мазки крови, которые фиксируют в этиловом спирте и окрашивают по Романовского – Гимза. Лейкоцитарную формулу выводят по результатам дифференцированного подсчета 100 клеток в окрашенных мазках крови под микроскопом с иммерсионной системой. Количество отдельных элементов крови выражают в процентах.

Животные относятся к категории больных по результатам однократного гематологического исследования. Животных, подозреваемых в заболевании лейкозом, подвергают дополнительному гематологическому исследованию через 1 – 2 месяца. При повторном подтверждении диагноза их считают больными.

Цитоморфологический метод

Сущность метода заключается в обнаружении в периферической крови и кроветворных органах накопления морфологически изменённых, преимущественно незрелых или патологических клеток.

Мазки, приготовленные на предметных стёклах, а также препараты – отпечатки, приготовленные из материала, взятого при биопсии, или из кусочков органов при убое животного, фиксируют в спирте, окрашивают по Паппенгейму и исследуют под микроскопом с иммерсионным объективом при увеличении 90.

Результаты считают положительными на лейкоз, если в мазках крови более 3 %, а в кроветворных органах более 10 % родоначальных, слабодифференцированных (пролимфоциты, лимфобласты, миелобласты) или опухолевых клеток, которые отличаются от нормальных по форме, величине, структуре и тождественны клеткам, образующим опухоли.

Электронно-микроскопический метод

Для прижизненной дифференциальной и экспресс – диагностики гемобластозов на начальных стадиях лейкозного процесса применяется трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия.

Сканирующая микроскопия позволяет оценить поверхностную архитектонику, а трансмиссионная – ультраструктуру инфицированных и «лейкозных» лимфоцитов. Метод электронной микроскопии включает в себя:

выделение лимфоцитов или лейкоцитов из крови или лимфы;

взятие кусочков лимфоузлов размером 0,5 * 1,0 см;

фиксацию, обезвоживание и заливку материала в эпоксидную смолу;

приготовление ультратонких срезов, их окраска солями тяжёлых металлов – цитратом свинца и уранилацетатом;

исследование в электронном микроскопе и фотографирование полученных объектов на фотопластины.

Вирус лейкоза КРС обнаруживается только in vitro при культивировании лейкоцитов крови и лимфы в течение 24, 48, 72 часов. Зрелые вирионы имеют ультраструктуру, типичную для онкорнавируса типа С. Вирусные частицы образуются на поверхности клетки (лимфоцита) или в цитоплазматических вакуолях.

Лейкозные лимфоциты имеют чёткие отличия от нормальных клеток. У них находят: полиморфизм ядра, гипертрофию мембранного аппарата, дубликацию ядерных и поверхностных мембран митохондрий, появление ядерных аномалий – ядерных карманов (самый важный признак).

В одном лимфоците обнаруживают от одного до шести и более ядерных карманов. Эти аномалии являются потогномоничными (специфическими) для лейкозных лимфоцитов.

Клиническая диагностика

Клинические признаки злокачественных заболеваний кроветворной ткани КРС – гемобластозов – складываются из наблюдений за больными животными. Они разнообразны и зависят от формы и стадии течения болезни. Выявляются чаще у животных 4 – 8 – летнего возраста и протекают в основном хронически (2 – 5 лет). Инфекционный процесс при лейкозе КРС характеризуется стадийностью. Различают 4 стадии болезни: инкубационную (онковирусная инфекция), начальную, развёрнутую и терминальную. Болезнь протекает вначале бессимптомно, а затем проявляется лимфоцитозом и (или) образованием опухолевых разрастаний в кроветворных, лимфоидных органах и тканях.

При клинической диагностике применяют общие методы исследования: осмотр животного, пальпацию поверхностных лимфоузлов, термометрию, аускультацию, перкуссию, ректальное исследование лимфоузлов и органов тазовой полости.

Помимо поражения кровеносной и лимфоидной систем часто в патологический процесс вовлекаются внутренние органы, не имеющие отношения к кроветворению. Поэтому и клинические признаки могут быть неспецифические, отображающие функциональные нарушения той или иной системы органов вследствие опухолевых разрастаний, и специфические, характерные для отдельных форм лейкоза.

Неспецифические признаки выражаются расстройствами функций организма общего характера. У животных ухудшается общее состояние, наблюдается отсутствие аппетита, снижение удоя, быстрая утомляемость, исхудание. Нередко отмечают расстройства деятельности желудочно-кишечного тракта (диарея, запоры, атония, тимпания преджелудков). Опухолевые разрастания в сердце обуславливают ослабление сердечной деятельности, провоцируют симптомы травматического перикардита, цианоз, желтушность слизистых оболочек, нарушения дыхания, отёки подкожной соединительной ткани в области подгрудка, живота, вымени, подчелюстного пространства. Наблюдают увеличение одной или нескольких долей вымени (вначале без нарушения лактации).

В патологический процесс нередко вовлекается печень, она увеличивается в объёме. При резком увеличении её задний край пальпируется через брюшную стенку.

Специфические (патогномонические) клинические признаки характеризуются увеличением поверхностных (предлопаточных, околоушных, нижнечелюстных, надколенных, надвыменных) и доступных ректальному исследованию внутренних лимфоузлов (глубокие паховые, крестцовые). Обнаруживается увеличение матки, мочевого пузыря, пучеглазие – экзофтальм за счёт опухолевых разрастаний. Характер и степень поражения лимфоузлов различны, зависят от формы болезни. Внутренние лимфоузлы поражаются чаще наружных. Увеличенные лимфоузлы без повышенной температуры, безболезненны, подвижны, эластичной или плотной консистенции. Они могут срастаться в конгломераты.

К специфическим признакам относится увеличение селезёнки. При лимфолейкозе её размеры возрастают в несколько раз, и селезёнка может достигать массы в 25 килограмм; в некоторых случаях капсула разрывается, и животное внезапно гибнет от внутреннего кровотечения.

Клинические признаки проявляются только у 10 – 30% больных лимфолейкозом животных. В результате непостоянного увеличения лимфоузлов при миелоидном, слабодифференцированном лейкозе, гематосаркомах поставить прижизненный диагноз по клиническим признакам даже в терминальной стадии болезни трудно. Необходимо проводить тщательное дифференциально-диагностическое исследование.

Предубойная диагностика лейкоза

Поскольку лейкоз КРС является хроническим, длительно протекающим заболеванием, в развитии болезни различают латентный период, субклиническую и клинико- анатомическую (опухолевую) стадии, то и предубойная диагностика имеет свою особенность.

В латентный период клинических признаков не наблюдается. Животные выглядят по всем клинико-анатомическим показателям здоровыми.

Субклиническая стадия может длиться в течение 2-6 лет и более. Эта стадия диагностируется с помощью серологического (РИД) и гематологического (исследование крови) методов исследования. Клинические признаки в этой стадии также не проявляются. При ветеринарно-санитарной экспертизе органов и туш после убоя животного с такой стадией лейкоза патологоанатомические исследования в них обнаруживаются редко. Гематологическая стадия характеризуется стойким повышением количества по сравнению с нормой лейкоцитов и лимфоцитов. При этом в крови появляются незрелые клетки (пролимфоциты, лимфобласты, миелоциты), что указывает на патологический процесс в гемопоэтической системе. При поступлении на убой таких животных следует уделять особое внимание послеубойной диагностике, что облегчает постановку диагноза на лейкоз. Лейкоз в клинико-анатомической стадии (опухолевой) встречается редко. Эта стадия является терминальной в развитии лейкозного процесса, наблюдается приблизительно у 20% больных животных, характеризуется появлением специфического опухолевидного увеличения лимфатических узлов, заканчивается, как правило, смертью животного.

Дифференциальный диагноз

Дифференцируют от многих хронически и остро протекающих болезней (туберкулёза, бруцеллёза, паратуберкулёза, инвазионных болезней, а также незаразных) тоже сопровождающихся лейкемоидными реакциями